1、HYPERLINK N:整理后.N:整理后.HYPERLINK N:整理后. t _parent更多資料請訪問.HYPERLINK E:還未拷貝企業治理治理知識(http:.)(.)HYPERLINK N:整理后.N:整理后.更多企業學院：HYPERLINK N:整理后.Shop./Shop/中小企業治理全能版183套講座+89700份資料HYPERLINK N:整理后.Shop40.shtml t _blank./Shop/40.shtml總經理、高層治理49套講座+16388份資料HYPERLINK N:整理后.Shop38.shtml t _blank./Shop/38.shtml中層治

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4、LINK N:整理后.Shop47.shtml t _blank./Shop/47.shtml何謂PCR 簡單的講，PCR確實是利用DNAHYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-473.html t _blank聚合酶對特定基因做體外或HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-952.html t _blank試管內(InVitro)的大量合成。差不多上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制.目前常用的技術,能夠將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。 PCR的要素 差不多的PCR須具備.要被復制的DNA模板(Template).

5、界定復制范圍兩端的引物(Primers).DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料及水。PCR反應包括三個要緊步驟，分不是 1).Denaturation2).Annealingofprimers,and3).Extensionofprimers。所謂Denaturing乃是將DNA加熱變性，將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以做為復制的模板.而Annealing則是令Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-polymerase)的作用下進行引物的延長(Extensionofprimers)及另一股的合成。PCR的歷史 PCR的進

6、展能夠講是從DNA合成酵素的發覺緣起。DNA合成酵素最早于1955年發覺(DNApolymeraseI),而較具有實驗價值及可得性的 KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發覺,但由于那個酵素是一種易被熱所破壞之酵素,因此不符合一連串的高溫連鎖反應所需。現今所使用的酵素(簡稱Taqpolymerase),則是于1976年從熱泉Hotspring中的細菌(ThermusAquaticus)分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個專門理想的酵素，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR的原始雛形概念是類似基因修復復制(DNArepairrepli

7、cation)，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發表第一個單純且短暫性基因復制(類似PCR前兩個周期反應)的實驗。而現今所進展出來的PCR則于1983由Dr.KaryB.Mullis進展出的，Dr.Mullis當年服務于一家物科技研究公司(Perkin- ElmerCetusCorporation).目前這家公司在PCR的相關儀器及原料上占有專門大的巿場。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式表了第一篇相關的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關的論文發表質量能夠講是令眾多其它研究方法難望其項背。在1989年，Science將PCR中的DNA合成酵素命名為當

8、年的風云分子(Moleculeoftheyear)，而PCR本身則列為年度的重要科學發明產物。因此，它的原發明者更在往后獲得諾貝爾的桂冠。 阻礙PCR的因素 PCR是特不直接、簡單又具有強大威力的技術。誠如一位當年參與PCR誕生的資深研究員HenryErlich所言”在分子生物學的領域中，只要擁有它，你便能夠無照營業” (PCRallowspeopletopracticemolecularbiologywithoutaliscence)。也因此，活用及慎用PCR是確保一定品質的必要條件。PCR本身盡管是一個單純的實驗技術，然而一個好的PCR反應及其產物則是受到專門多因素的阻礙。這些因素色括反應

9、中各種原料的濃度(Taq.Polymerase,primers,dNTPs,MgCl2)，也包括整個反應中各步驟的溫度與時刻的設定。因此DNA模板(Template)與引信(Primers)本身條件也占有一定的重要性。近來的觀念中，共溶劑諸如Dimethylsulfoxide(DSMO)、glycerol、 ForamideandTetramethylammoniumchloride(TMAC)也對整個反應產生若干重要的阻礙。 PCR的運用 PCR除了是一個診斷工具外，更重要的是它有廣泛的運用。PCR本身可直接用來鑒定特定基因的存在與否，也能夠用來偵測基因是否有異常(Genemutation,

10、deletion,andrearrangement)。例如，在醫學上對遺傳疾病或腫瘤癌癥的診斷及預后的評估；對細菌、病毒及霉菌感染的診斷。它也可成為一個生產線進而大量復制特定的基因進行基因密碼的讀取(DNAsequencing)及其它的運用。舉凡對生物標本及法醫學上的樣本鑒定，從單一毛發、一只精蟲或一滴血液、唾液來找出兇手。也能夠做DNA指紋(Fingerprints)比對關心親子關系的鑒定。PCR更能夠用于器官移植組織兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，經由PCR的運用也產生重大的進展。近來，在生物醫學的研究上，特不是細胞間訊息的傳遞分子，諸如介白質(Interleukines)及各種H

11、YPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-641.html t _blank生長因子(Growthfactors)基因的表現都可用 PCR來進行質與量的分析。 PCR污染及解決對策PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產物殘留污染的問題。 一污染的預防 進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。 （一）劃分操作區：目前，一般PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但不管是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行： 1.標本處理區，包括擴增摸板

12、的制備； 2.PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增； 3.產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。 各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備PCR擴增產物分析產物處理。 切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。（二）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-347.html t _blank超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-925.html t _blank吸頭需固定放于其

13、中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA： 1PCR用水應為高壓的雙蒸水； 2引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制； 3引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時刻，以備發生污染時查找緣故。 (三)實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的緣故，樣品間的交叉污染也是緣故之一。因此，不僅要在進行擴增反應是慎重認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意： 1.戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套； 2.使用一次性HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-925.html t _blank吸頭，嚴禁與PCR 產物分

14、析室的吸頭混用，吸頭不要長時刻暴露于空氣中，幸免氣溶膠的污染； 3.幸免反應液飛濺，打開HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-958.html t _blank反應管時為幸免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應趕忙更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4.操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，如此即能夠減少操作，幸免污染，又能夠增加反應的精確度； 5.最后加入反應模板，加入后蓋緊HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-958.html t _blank反應管； 6.操

15、作時設立陰陽性對比和空白對比，即可驗證PCR反應的可靠性，又能夠協助推斷擴增系統的可信性； 7.盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種專門的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區； 8.重復實驗，驗證結果，慎下結論。 二追蹤污染源 假如不慎發生污染情況，應從下面幾條動身，逐一分析，排除污染。 （一）設立陰陽性對比：有利于監測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對比時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣品，因強陽性對比可產生大量不必要的擴增序列，反

16、而可能成為潛在的污染源。假如以含靶序列的重組質粒為對比，100個拷貝之內的靶序列就足以產生陽性擴增。陰性對比的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，能夠從其它方法（Sourthern印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR體系中各試劑的時機對比，即包括PCR反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監測試劑中PCR產物殘留污染是特不有益的。假如擴增結果中試劑對比為陽性結果，確實是某一種或數種試劑被污染了。現在，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應立即處理。 （二）環境污染：在排除試劑污染的

17、可能性外，更換試劑后，若不久又發覺試劑被污染了，假如預防措施比較嚴密，則考慮可能為環境污染。 環境污染中常見的污染源要緊有： 1.模板提取時真空抽干裝置； 2.凝膠電泳加樣器； 3.電泳裝置； 4.紫外分析儀； 5.切膠用刀或手術刀片； 6.HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-47.html t _blank離心機； 7.冰箱門把手，冷凍架，門把手或實驗臺面等； 現在可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結果。 8.氣溶膠。假如通過上述追蹤實驗，仍不能查找到

18、確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產物的氣溶膠造成的，現在就應該更換實驗場所，若條件不同意，則重新設計新的引物（與原引物無相關性）。 三污染處理 （一）環境污染 1.稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤； 2.紫外照耀（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照耀30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產物污染時，要考慮PCR產物的長度與產物序列中堿基的分布，UV照耀僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照耀時，PCR產物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體

19、，且UV照耀還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-674.html t _blank核苷酸的序列。在受照耀的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環丁烷型嘧啶復合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內的交聯和 DNA斷裂等）均可終止TaqDNA聚合酶的延伸。這些位點的數量與二聚體位點相當。假如這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機分布，一個 500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個如此的分子中每個分子中會至

20、少有一處損傷。相反，假如100bp的片段，每條鏈上僅有 6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這確實是UV照耀有一定的片段長度限制的緣故。（二）反應液污染 可采納下列方法之一處理： 1.DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室溫反應30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要明白污染DNA的序列； 2.內切酶法：選擇識不4個堿基的內切酶（如MspI和TaqI等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識不特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進行PCR； 3.紫外照耀法：未加模板和Taq聚合酶的P

21、CR混合液進行紫外照耀，注意事項與方法同上述UV照耀法； 4.g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA，2.0kGy可破壞104拷貝的質粒分子，4.0kGy仍不阻礙PCR，但高于此限度會使PCR擴增效率下降。引物可受照耀而不阻礙PCR，g射線是通過水的離子化產生自由基來破壞DNA的。（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照耀的去污染作用對500bp以下的片段效果不行，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為 300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和確信。 1.原理：在PCR產物或引物中用dU代替dT。這種dU化的PCR產物與 UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶

22、堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG對不含dU的模板無任何阻礙。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。 2.dUTP法：用 dUTP代替dTTP，使產物中摻入大量dU。在再次進行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產物的殘留污染。由于UNG在PCR循環中的變性一步便可被滅活，因此可不能阻礙含dU的新的PCR產物。 3.dU引物法：合成引物時以dU代dT，如此PCR產物中僅5端帶 dU。UNG處理后，引物失去了結合位點而不能擴增。對長片段（1-2kb以上）的擴增用

23、dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。 dU引物最好將dU設計在3端或近端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。 4.優點：能夠去除任何來源的污染；UNG處理能夠和PCR擴增在同一個反應管內進行；由于擴增產物中有大量dU存在，可完全消除污染源。 5.需注意的是摻入dUTP的DNA不應對產物的任何操作有阻礙，在進行PCR產物克隆時，應該轉化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉化產物會被受體菌UNG消化掉。 （四）固相捕獲法 用于去除標本中污染的核酸和雜質，原理如下：1）用一生物素標記的單鏈RNA探針與待擴核酸雜交，雜交區域是非擴增區；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶

24、有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴增產物和雜質；3）洗脫靶分子后用特異引物擴增非RNA探針雜交區域。第2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標本是否被擴增產物或重組質粒污染。 （五）RS-PCR法（RNA-specificPCR） 也稱為鏈特異性PCR，要緊指用于 RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不阻礙PCR的敏感性。其關鍵在于設計引物，逆轉錄引物的3端（A區）有20個HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-674.html t _blank核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5端20個核苷酸（C區）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉錄后，經

25、超速離心使cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環中用逆轉錄引物的B區和引物C進行擴增加尾cDNA，而污染的DNA或質粒DNA才可不能被擴增。 （六）抗污染引物法 該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質粒的位點。這一區域只存在完整的原病毒中，在重組質粒中，這一區域分成兩個區域與克隆位點被。假如重組質粒污染了標本，也不能擴增出任何條帶，即使出現了擴增帶，其大小也與預期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增，因此只要出現預期大小的擴增帶就能夠證明標本是陽性的，該法試用于環狀靶分子系列。 四其它PCR檢測方法： （一）兩步法：是指在用套式

26、 PCR方法擴增某些含量低微的標本時，兩對引物在同一個管中以簡化步驟，減少污染。通常第一步進行20-25個循環，擴增外引物片段；第二步再進行10個循環，擴增內引物片段。兩步法對內外引物的Tm值有專門要求，即內外引物的退火溫度高（如68），在此溫度下內引物不與模板退火，然后降低退火溫度（至 55）再擴增內引物片段，如此，在操作過程中，僅打開PCR反應管一次，大大減少了污染的可能性。（二）熒光法：亦稱熒光PCR技術（fluoresencePCR,F-PCR），是1995年由美國PE公司首先研制成功的，它融匯了 PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，電腦同步跟蹤，數據自動化處理，直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結果，不需要做 PCR后處理或檢測，完全閉管操作。探針標