1、超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用法快速檢測尿液和血漿中鵝膏毒摘要】建立了同時快速檢測尿液和血漿中3種鵝膏毒肽和2種鬼筆毒肽的超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用分析方法。尿液樣品直接進樣，血漿樣品經乙腈沉淀除蛋白后，在uplhsst3色譜柱上別離，正離子電噴霧多反響監測(r)形式檢測，基體匹配標準外標法定量。尿液和血漿樣品的線性范圍分別為2100和1100g/l；加標回收率分別在92.0%108.0%和85.0%100.0%的范圍內；相對標準偏向為1.0%22.0%和2.0%22.0%(n=6)；樣品的檢出限為0.21.0g/l和0.10.5g/l(s/n=3)。本方法靈敏，簡單，快速，特異性強。

2、【關鍵詞】超高效液相色譜三重四極桿質譜法；鵝膏毒肽；鬼筆毒肽；尿液；血漿rapidsiultaneusdeterinatinffiveaatxinsandphalltxinsinhuanurineandplasabyultraperfraneliquidhratgraphyupledithtriplequadrupleassspetretryzhangxiu-ya*，aixin-xin(enzhuenterfrdiseasentrlandpreventin，enzhu325001)abstratspeifidetetinfaatxinsandphalltxinsinbdyfluidsisnee

3、hisstudy，arapidethdfrthesiultaneusdeterinatinf-，-and-aanitin，phallidinandphallaidininhuanurineandplasaasfirstdevelpedbyultra-perfraneliquidhratgraphy-tandeassspetretry.urinesapleasdiretlyinjetedinttheseparatinsysteandplasasapleasinitiallypreparedbypreipi

4、tatinfprteinsith1%aetiaidinaetnitrile.thetxinasanalyzednanaquityuplhsst3lunusingagradientprgraithayletief9in，anddetetedbypsitiveeletrsprayinizatintandeassspetretryintherde，andquantifiedbyatrix-athstandardslutin.thedetetinliits(s/n=3)fthetxinsereithin0.2-1g/land0.1-0.5g/lfrurineandplasa，respetively.t

5、hestandardurveserelinearintherangef2-100g/lfrurineand1-100g/lfrplasa.theaveragereveriesere92.0%-108.0%and85.0%-100.0%frthetxinsspikedinurineandplasa，ithrsdsf1.0%-22.0%and2.0%-22.0%(n=6)，respetively.theethdassiple，seletiveandsensitivetdetettheaatxinsandphalltxinsinurineandplasafrbthlinialandfrensipur

6、pseskeyrdsultraperfraneliquidhratgraphy-tandeassspetretry；atxins；halltxins；rine；lasa1引言毒蘑菇又稱毒蕈，我國約有100種，有10多種可引起人類嚴重中毒。引起中毒的毒蘑菇毒素類型較多，主要有鵝膏毒肽類(aatxins)和鬼筆毒肽類(phalltxins)，它們分別屬于雙環八肽和雙環七肽。目前，己經別離出9種鵝膏毒肽，其中-鵝膏毒肽、-鵝膏毒肽和-鵝膏毒肽毒性大，在毒蘑菇中含量高，為引起中毒的主要毒素。鵝膏毒肽屬慢性毒素，對人的致死量大約為0.1g/kg體重，食用后至少15h后才出現中毒病癥，其毒性比鬼筆毒肽強2

7、0倍。它們能強烈抑制細胞rna聚合酶的活性，從而阻礙了蛋白質的合成，引起多種臟器細胞特別是肝、腎細胞的壞死，912d內死亡，死亡率高達90%。鬼筆毒肽共有7種，其中羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽為主要毒性成分。鬼筆毒肽屬速效毒素，動物靜脈或腹腔注射實驗，25h內死亡。該毒素能專一性地與細胞中肌絲蛋白(f-atin結合，從而打破肌絲蛋白與肌球蛋白(g-atin)之間聚合和解聚的動態平衡，形成大量f-atin毒肽復合體13。蘑菇中毒，特別是鵝膏毒肽引起的中毒，中毒病癥在大量細胞被損壞后才出現，因此病死率高。建立快速、準確檢測尿液和血液中毒蘑菇毒素確實證檢測方法，對于疑似中毒病人的盡早診斷，降低死亡

8、率具有重要意義。目前，毒蘑菇毒素的檢測多集中于鵝膏毒肽類的檢測，檢測方法主要有放射性免疫測定法4、毛細管區帶電泳法5、反相液相色譜法68和液相色譜質譜聯用法911等，這些方法多針對毒蘑菇中鵝膏毒肽的含量測定。由于鵝膏毒肽的毒性較大，特別當中毒病癥出現時大局部的毒素都己進入靶器官，尿液和血漿中濃度較低，常規的檢測方法無法檢出。aurer等12采用免疫親和柱凈化液相色譜質譜聯用法測定尿液和血漿中-鵝膏毒肽和-鵝膏毒肽，檢出限為2.5g/l。filigenzi等13采用液相色譜-線性離子阱質譜聯用法，以s/s/s形式測定中毒病人血清和肝臟中-鵝膏毒肽，采用固相萃取法將樣品富集4倍，-鵝膏毒肽的檢出限

9、分別為0.25ng/g和0.5ng/g。本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質譜法同時測定了尿液和血漿中的-鵝膏毒肽、-鵝膏毒肽、-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽，特別合適于毒蘑菇中毒確實證分析。一次進樣分析僅需9in。本方法靈敏，快速，簡便，選擇性好。2實驗局部2.1儀器與試劑aquityupl-quattrpreierxe超高效液相色譜-串聯質譜儀配有電噴霧源(美國aters公司)，asslynx4.1工作站；s2旋渦混旋器德國ika公司；hup-100手持式超聲波細胞破碎儀(天津恒奧科技開展)；tdz5-s臺式離心機湘儀離心機儀器；n-evap氮吹儀(12孔，美國rganatin

10、公司)；2510超聲波清洗機美國bransn公司；gradienta10ill-q超純水器法國illipre公司；針頭過濾器(13ghp0.2，美國pall公司)。乙腈和甲醇hpl級，德國erk公司)；乙酸銨(hpl級，fluka公司)；-鵝膏毒肽(90%)、-鵝膏毒肽(90%)、-鵝膏毒肽(90%)、二羥鬼筆毒肽(95%)和羧基二羥鬼筆毒肽(90%)均購自alexisbiheials公司，用甲醇配制成100g/l標準貯備溶液，保存于-35冰箱中。表1梯度洗脫程序略table1ultraperfraneliquidhratgraphi(upl)gradientprgra2.2液相色譜條件aqu

11、ityuplhsst3色譜柱1002.1，1.8，aters公司)；vanguardbeh18保護柱52.1，1.7，aters公司)；流動相a為2l/l乙酸銨水液，流動相b為2l/l乙酸銨甲醇液，采用梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；柱溫：40；進樣10l。2.3質譜條件電噴霧離子源正離子多反響監測(r)形式。esi+毛細管電壓：3.5kv；離子源溫度：120；錐孔反吹氣流量：50l/h，脫溶劑溫度：350，脫溶劑氣流量：600l/h，碰撞室氬氣壓力：0.346pa。其它質譜參數見表2。運行開場時，色譜柱流出液經六通切換閥切換至廢液中，直到1.80in。質譜從1.80in開場采集數據直到4.70

12、in完畢，同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。表2質譜的r參數略table2sparaetersfrultiplereatinnitring*定量離子對(quantifiatinalinpair)。2.4樣品的前處理方法2.4.1尿液取適量尿液過0.2濾膜，待測。同時在6支試管中分別按標準曲線的濃度參加適量標準溶液，參加空白尿液至1000l，混勻，過0.2濾膜，制作工作曲線系列。2.4.2血漿汲取1000l血漿于10l試管中，參加3.0l1%醋酸-乙腈，用手持式超聲波細胞破碎器均質2in，以4000r/in離心4in，汲取2.0l上清液于10l試管中，55水浴氮氣吹干，參加250l流動相，

13、超聲1in，旋渦30s，過0.2濾膜，待測。同時在6支試管中分別按標準曲線的濃度參加適量標準溶液，參加空白血漿至1000l，混勻，放置30in后，參加3.0l1%醋酸-乙腈，與樣品一起處理，制作工作曲線系列。3結果與討論3.1質譜條件的優化在電噴霧正離子r檢測方式下對質譜測定條件進展優化，使目的化合物的分子離子對信號到達最正確。它們的二級質譜圖見圖1，可能的裂解方式見圖2。遵循國際慣例，確證分析需要4個識別點，故每個化合物選擇2對分子離子對，同時設定適宜的峰駐留時間，確保色譜峰的采樣點數在1520點，從而進步定量分析的重復性。優化后的測定條件見表2。圖1-鵝膏毒肽(a)、-鵝膏毒肽(b)、-鵝

14、膏毒肽()、羧基二羥鬼筆毒肽(d)和二羥鬼筆毒肽(e)的電噴霧二級質譜圖略fig1prdutinassspetraf-aanitin(a)，-aanitin(b)，-aanitin()，phallaidin(d)andphallidin(e)圖種蘑菇毒素裂解方式略ig.2prpseddissiatinreatinehanisfrtxins3.2色譜條件的優化采用aquityuplhsst3柱為分析柱，乙酸銨-甲醇為流動相并進展優化。實驗發現，流動相中乙酸銨的濃度為2l/l時最正確。增加乙酸銨的濃度會抑制質譜信號，參加甲酸也會抑制質譜響應，最終流動相a選用2l/l乙酸銨水溶液，流動相b選用2l/

15、l乙酸銨-甲醇液。選擇適當的梯度洗脫程序使5種毒素別離完全，一次梯度分析僅需9in。3.3樣品前處理方法的優化對于公共衛生突發事件和臨床搶救，分析速度最為重要。本研究中尿液樣本可以直接進樣，與溶劑標準相比擬5種組分的回收率在74.0%116.0%之間。雖然由于基體成分的影響使得檢出限升高數倍，但方法還是足夠靈敏，檢出限為0.21g/l，可以滿足檢測的需求；血漿樣品采用1%醋酸-乙腈沉淀去除蛋白等雜質，提取液再經氮氣吹干，用小體積的流動相復溶，濃縮1倍，經液質分析顯示基體成分不影響待測物的檢測。在分析測試時，樣品處理液中強極性和弱極性雜質成分使用六通切換閥切換至廢液而不進入質譜儀，分析100份樣

16、品后不需清洗質譜儀的樣品錐，同時采用基體匹配標準外標法定量，有效補償了基體效應，方法簡單、快速。圖乙腈中醋酸含量對待測物提取回收率的影響略ig.3effetfnentratinfaetiaidinaetnitrilenthereveriesftxins比擬了乙腈、甲醇和丙酮為沉淀劑的效果，結果說明，乙腈沉淀效果最好，蛋白沉淀完全，易于離心別離。實驗發現，血漿樣品只用乙腈沉淀，-鵝膏毒肽的回收率偏低，僅有6.7%，在乙腈中參加醋酸可進步它們的回收率，乙腈中醋酸含量對它們回收率的影響見圖3。本方法最終選用1%醋酸-乙腈為血漿的沉淀劑。血漿樣品采用超聲均質可進步提取率，防止蛋白沉淀物包裹待測物。3.

17、4線性范圍和檢出限用空白樣品參加標準溶液制作6點系列標準工作溶液，在選定的色譜和質譜條件下進展測定。采用asslynx4.1中targetlynx組件以定量離子對的峰面積對基質標準系列濃度作圖，血漿和尿液中5種毒素的線性相關系數分別在0.99800.9998之間，符合線性關系的要求。在本法操作條件下，信噪比為3時，定量離子對信號對應的樣品濃度作為檢出限(ld)；信噪比為10時的樣品濃度作為定量限(lq)，詳細結果見表3。本方法靈敏度高，線性范圍寬，可以滿足公共衛生突發事件、法醫毒物學和臨床毒物學檢測的需要。假如樣品濃度過高，那么應稀釋后重新進樣測定。表3方法的線性范圍和檢出限略table3al

18、ibratinurvesanddetetinliitsfrushrtxinsinhuanurineandplasa*：x為濃度nentratinfanalyteg/l；y為峰面積hratgraphipeakarea。3.5方法的回收率和精細度用空白血漿和尿液進展加標回收率和精細度實驗，樣品添加不同濃度的標準溶液后，放置30in，使待測成分與樣品基體成分互相作用到達平衡，再按樣品前處理方法進展操作，其回收率和精細度結果見表4。尿液和血漿樣品的加標回收率分別在92%108%和85%100%的范圍內，相對標準偏向分別為1%22%和2%22%，符合痕量分析的要求。血漿加標樣品的色譜圖見圖4。圖4空白血漿加標樣品r色譜圖1g/l略fig.4upl-s/shratgrasfblankplasaspikedfivetxinsatthelevelf1g/la，a：-鵝膏毒肽(-anitin)；b，b：-鵝膏毒肽(-anitin)；，：-鵝膏毒肽(-anitin)；d，d：羧基二羥鬼筆毒肽(hallaidin)；e，e：二羥鬼筆毒肽(hallidin)。表4加標回收率和精細度n=6略table4reveriesandrsdsfushrtxinsinurineandplasa