1、時間分辨熒光免疫分析法乙型肝炎血清標志物分析靈敏度的建立與分析Establishment and analysis of analytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved Fluoroimmunoassay譚玉華 陳鮮美 盧順舵 沈 健（廣州市市豐華生生物工程程有限公公司，廣廣東廣州55107730）摘 要要 對乙乙型肝炎炎表面抗抗原和表表面抗體體定量測測定試劑劑盒（時時間分辨辨熒光免免疫分析析法）的的分析靈靈敏度進進行建立立與分析析，以便便更好的的指導臨臨床診斷斷和進行行流行病病學研究究。通過過實

2、驗研研究，乙乙型肝炎炎病毒表表面抗原原定量檢檢測試劑劑盒和表表面抗體體定量檢檢測試劑劑盒的檢檢測低限限分別為為0.003566ng/mL和和0.5548 mIUU/mLL，生物物檢測限限分別為為0.2200 ng/mL和和5.000mmIU/mL，功能靈靈敏度分分別為00.2000 nng/mmL和5.000mmIU/mL，線性范范圍分別別為0.2000 ngg/mLL-3000nng/mmL和55.000 mIIU/mmL-112000 mIIU/mmL，并并達到中中國藥品品生物制制品檢定定所檢定定要求。時間分分辨熒光光免疫分分析法乙乙型肝炎炎病毒定定量檢測測試劑盒盒具有靈靈敏度高高，線性性

3、范圍寬寬，特異異性強的的特點，已能有有效應用用于臨床床體外診診斷和流流行病學學研究。關鍵詞時間分分辨熒光光免疫分分析；乙乙型肝炎炎；標志志物；分分析靈敏敏Estaabliishmmentt annd aanallysiis oof aanallytiic ssenssitiivitty oof hhepaatittis B vviruus sseruum mmarkkerss byy Tiime-ressolvved FluuorooimmmunooasssayTAN Yu-huaa,CHHEN Xiaan-mmei,LU Shuun-dduo,et al. Guuanggzhoou FFen

4、gghuaa Biio-eengiineeerinng CCo.,LTDD,Guuanggzhoou 55107730 ChiinaAbsttracctTo esttabllishh annd aanallysee thhe aanallytiic ssenssitiivitty ffor thee quuanttifiicattionn kiits forr heepattitiis BB viiruss(HBBV) surrfacce aantiigenn(HBBsAgg) aand anttiboody to HBssAg (annti-HBss),tthe kitts wweree m

5、eeasuuredd byy Tiime-ressolvved Fluuorooimmmunooasssay(TRFFIA),inn orrderr too thhe bbettterinsstruuctiion cliiniccal diaagnoosiss annd ccondductts tthe epiidemmiollogyy reeseaarchh. TThrooughh thhe sstuddy,tthe lowwer limmit of dettecttionn off thhe qquanntifficaatioon kkitss foor HHBsAAg aand antt

6、i-HHBs forr 0.03556ngg/mLL annd 00.5448 mmIU/mL resspecctivvelyy, tthe bioologgicaal llimiit oof ddeteectiion is 0.2200 ng/mL andd 5.00 mIUU/mLL reespeectiivelly, thee fuuncttionn seensiitivvityy iss 0.2000 ngg/mLL annd 55.000 mIIU/mmL rresppecttiveely, thhe llineear scoope is 0.2200 ng/mL-300 ng/mL

7、 andd 5.00 mIUU/mLL-12200 mIUU/mLL reespeectiivelly, andd paasseed tthe exaaminnatiion of thee Naatioonall Innstiitutte ffor Conntrool oof PPharrmacceutticaal aand Bioologgicaal PProdductts. Thee quuanttifiicattionn kiits forr HBBV sseruum mmarkkerss byy TRRFIAA ,wwhicch hhas thee hiigh sennsittivii

8、ty, thhe wwidee liineaar sscoppe,tthe goood sspeccifiicitty,ccoulld hhavee thhe eeffeect to usee inn thhe cclinnicaal iin vvitrro ddiaggnossis andd thhe eepiddemiioloogy ressearrch.Key worrds Timme-rresoolveedFFluooroiimmuunoaassaay; Heppatiitiss B virrus;Marrkerr;Annalyyticc seensiitivvityy乙型肝炎炎病毒表

9、表面抗原原（HBBsAgg）的檢檢出是乙乙型肝炎炎病毒（HBVV）感染染的金標標準。乙乙型肝炎炎病毒表表面抗體體（抗-HBss）是對對HBVV具有保保護性的的免疫指指標，它它的檢出出有助于于乙型肝肝炎（簡簡稱：乙乙肝）的的預防與與接種。隨著時時間分辨辨熒光免免疫分析析法（TTRFIIA）在在定量檢檢測HBBsAgg和抗-HBss中的應應用，對對HBssAg和和抗-HHBs的分析析靈敏度度有了進進一步提提高，并并且定量量結果取取代了定定性報告告，為臨臨床診斷斷提供了了更多的的信息。在實驗驗室，對對試劑盒盒和方法法學有必必要建立立自己的的可定量量報告的的生物檢檢測限或或對試劑劑盒和方方法學說說明的

10、檢檢測限進進行確認認1-2，以便更更好的指指導臨床床的診斷斷。作者者在此對對乙型肝肝炎HBBsAgg和抗-HBss定量測測定試劑劑盒（時時間分辨辨熒光免免疫分析析法）的的分析靈靈敏度進進行了建建立與分分析。1 材材料與方方法1.1 材料料與儀器器 高高濃度HHBsAAg和抗抗-HBBs血清各各5.000mLL，乙型型肝炎病病毒表面面抗原定定量檢測測試劑盒盒（國藥藥準字SS2000501108）和表面面抗體定定量測定定試劑盒盒（國藥藥準字SS2000501110）（時間間分辨熒熒光免疫疫分析法法），以以及DEEM-IIII自自動酶標標洗板機機和FWWZ-II振蕩儀儀均由廣廣州市豐豐華生物物工程有

11、有限公司司提供。“檢測HHBsAAg血清清Pannel國國家參考考品”（批準準文號：911衛生生參字000033）和“檢測抗抗-HBBs血清PPaneel國家家參考品品”（批準準文號：911衛生生參字000044）購于于中國藥藥品生物物制品檢檢定所。VICCTORR2TMD 14220 MMULTTILAABELL COOUNTTER（時間分分辨熒光光免疫檢檢測儀）為Waallaac產品品。1.2 方法法 采采用試劑劑盒0標標準品為為空白液液（BLLANKK），將將高濃度度HBssAg和和抗-HHBs血清加加入空白白液做系系列稀釋釋，組成成0.0000ng/mL、0.2200 ng/mL、0.

12、5500 ng/mL、1.000ngg/mLL、2.00nng/mmL和55.000 ngg/mLL的HBBsAgg系列檢檢測限品品，以及及0.0000mIUU/mLL、5.000mIIU/mmL、110.00mIUU/mLL、200.0mmIU/mL、30.0mmIU/mL和和40.0mmIU/mL的的抗-HHBs系列檢檢測限品品。并將將高濃度度HBssAg和和抗-HHBs血清分分別用空空白液按按一定比比例稀釋釋，各配配得線性性檢測品品。各用用三批試試劑測定定“檢測HHBsAAg血清清Pannel國國家參考考品”和“檢測抗抗-HBBs血清PPaneel國家家參考品品”，同時時做標準準曲線。H

13、BssAg采采用雙抗抗體夾心心法，抗抗-HBBs采用雙雙抗原夾夾心法，均按試試劑盒說說明書嚴嚴格操作作。空白白樣品做做20次批批內重復復測定；對其它它系列檢檢測限品品做天間間重復測測定，共共連續做做20天天。實驗驗均在VVICTTOR22TMD 14220 MMULTTILAABELL COOUNTTER上上測定熒熒光值（RF值值）。收收集數據據，按文文獻33的方方法分析析TRFFIA 法HBBsAgg和抗-HBss定量檢檢測試劑劑盒的檢檢測低限限（LLLD）、生物檢檢測限（BLDD）、及及功能靈靈敏度（FS），參考考文獻4及及血清PPaneel國家家參考品品說明書書對試劑劑盒進行行檢定。2

14、結結果2.1 分析析靈敏度度 空空白樣品品做200次批內內重復測測定，其其它系列列檢測限限品做天天間重復復測定，共連續續做200天。其其系列檢檢測限品品的RFF值檢測測結果詳詳見表11。表1 乙乙型肝炎炎表面抗抗原和表表面抗體體系列檢檢測限品品的熒光光值檢測測結果HBsAAg（ng/mL） 0.00000.2000 0.5500 1.0022.000 5.000 抗抗-HBBs（mIUU/mLL） 00.0000 5.00 100.0 200.0 30.0 440.00 熒光值116333 33448 556311 100012 1772911 4410664 16880 5555668843

15、11 1566872211448 3008377115333 34113 555133 104467 1775811 3397557 14332 445733775755 1488972214775 3447000115311 35228 661222 96676 1770333 3380115 15113 555244998177 1999042280448 4000688114911 35664 556822 98863 1773433 3381665 15448 669511887100 1933522288442 3776911113411 32444 555933 100089 17

16、78722 4434663 13887666800889766 1977652299442 3994388113233 33442 553666 120011 1990000 4427557 15007663644993988 2111003301773 3774800113688 33990 552166 97788 1556500 3349888 14991448288882033 1488842213227 3003722114299 33444 556500 100031 1336588 3325443 14338448399770788 2133272215111 311768811

17、5688 32669 552944 92229 1771066 3378554 14553559822994733 2188183302111 3888422116944 32117 557199 94495 1558733 3358998 15337663977990966 2077552294000 3552155114866 37442 661111 128882 1880233 4416883 15665446911779466 2066403304006 4003633113600 37339 774933 104442 1888266 4409226 165545533667791

18、99 2077933304447 4002900114644 39223 663566 122242 1888788 4434889 17444448777772555 1533152250661 3552877113799 45007 665744 105561 1886400 4411551 12771443488772966 1388742265448 3002822112811 34662 667322 109951 1990455 4485330 12775551388669800 1700952246667 3446899117688 36550 662444 121122 199

19、3366 4482006 12227555222665011 1755202243777 3447566114233 33884 555488 115514 2110544 4493662 12554558011 1007533 2099273328882 3888144113777 46554 551577 122210 2008088 4471227990222 2011923324774 4006977114999 35881 551155 133329 2220100 4463888 12991 552455 990033 1777752265889 3889

20、177114188 36773 661333 125587 2331499 4402669 14333 552111 996222 1900762292227 40099002.1.1檢測低低限HBsAAg空白白平均值值BLAANK均值）為為 14468.30，標準偏偏差（SSD）為為1266.566，抗-HBss空白平平均值為為14551.995，標準偏偏差（SSD）為為147.49。這里里采用999.77%的可可能性來來計算檢檢測低限限。按文文獻11的方方法分析析：LLDDHBsAAg= BLLANKK均值+33S0 =14668.330+331226.556=18447.998；LLLD

21、抗抗-HBBs=18994.442。HHBsAAg若以以空白RRF值均均值為檢檢測的起起點0,那么有有99.7%的的可能性性,每次次只做一一個空白白時,出出現最高高的空白白RF值值較該空空白RFF值均值值高1226.556的33倍,即即3799.688，這些些RF值值相當于于樣品具具有的HHBsAAg，即為本本方法HBsAAg的檢檢測低限限。同理理得，較較該空白白RF值值均值高高4422.477這些RFF值即為為本方法抗-HBBs的檢測測低限。將上面面所有的的RF值值減去空空白RFF值均值值，然后后求每組組的均值值和標準準差。見見表2。表2 乙乙型肝炎炎表面抗抗原和表表面抗體體檢測系系統分析析

22、靈敏度度的計算HBsAAg（ng/mL） 00.2000 00.5000 1.000 2.000 5.00 抗-HHBs（mIUU/mLL） 5.00 100.0220.00 30.0 40.0 X 21330.440 43994.115 95006.775 1169440.555 401113.45440355.900 669699.255 1171882.885 258812.80 351122.85SD 3884.994 6007.006 12666.449 22223.779 46683.79 7233.744 110888.422 25441.000 38826.13 36632.7

23、0CV（%） 18.07 13.82 13.32113.113 111.688117.993 115.662 14.79 144.822 100.344X-3SD9975.58 25572.97 57707.28 102269.17 2660622.099 18664.666 37004.000 995599.866 114344.411 2242224.775 3779.668 3379.68 3779.668 3779.668 3799.688 4422.477 4442.447 4442.474442.47 4422.477 現在0.2000 ngg/mLLHBsAAg組減減去空白白后的

24、RRF值均均值為221300.400，假定定這段范范圍內HHBsAAg量和和RF值值間呈線線性.因因此3779.668相當當于：00.2000（3779.668/221300.400）=00.03356（ng/mL）。所以以本法HHBsAAg的檢檢測低限限為0.03556ngg/mLL。同理可可得：本本法抗-HBss的檢測測低限為為0.5548 mIUU/mLL。2.1.2生物檢檢測限由表2得得, 0.2000 ngg/mLLHBsAAg組999.77%的最低RFF值為（21330.440-33384.94），即9755.588，已大大于空白白RF值值均值可可能有的的最高值值3799.688，

25、說明明0.2200 ng/mL的的樣品RRF值有有99.7%的的可能性性,一定定大于空空白的RRF值，能定量量地報告告結果。0.2200 ng/mL為為本方法HBsAAg的生生物檢測測限。同同理可得得，本方法抗-HHBs的生物物檢測限限為5.00 mIUU/mLL。2.1.3功能靈靈敏度從從表2中可知知，0.2200 ng/mLHHBsAAg組和5.00 mIUU/mLL抗-HHBs組的重重復檢測測變異系系數CVV%分別別為18.07%和177.933%，重復檢檢測變異異系數接接近并小小于200%55。所以，本方法HBsAAg和抗-HHBs的功能能靈敏度度為0.2000 ngg/mLL和5.0

26、00mmIU/mL。2.2 線性性范圍 HBBsAgg和抗-HBss的血清清線性檢檢測品，經三批批試劑檢檢測，HHBsAAg線性性范圍為為0.2200 ng/mL-3000 ngg/mLL，抗-HBss線性范范圍為55.000 mIIU/mmL-112000 mIIU/mmL。2.3 血清清Pannel國國家參考考品檢定定 三三批HBBsAgg和抗-HBss定量檢檢測試劑劑盒分別別測定“檢測HHBsAAg血清清Pannel國國家參考考品”和“檢測抗抗-HBBs血清PPaneel國家家參考品品”：線性性參考品品測定值值均與標標定值相相關系數數 r 988.0%，測定定值與其其真實值值的相對對誤差

27、不不大于115.00%；精精密性參參考品CCV%10.0%；HBssAgadrr亞型及及抗-HHBs靈敏度度參考品品的測定定值與其其真實值值的相對對誤差不不大于110.00%，HHBsAAgadrr、adww和ay亞型型參考品品最低檢檢出量不不高于00.2000ngg/mLL；抗-HBss靈敏度度參考品品最低檢檢出量不不高于55.000 mIIU/mmL。討論分析靈敏敏度（檢檢測限）是檢測測系統能能檢出的的最低分分析物濃濃度，包包括具有有定性意意義的檢檢測低限限（LLLD）和和具有定定量意義義的生物物檢測限限（BLLD）及及功能靈靈敏度（FS），特別別是定量量檢測報報告能為為臨床對對患者的的治

28、療監監測和隨隨訪的正正確判斷斷提供更更多的信信息。因因此，在在檢測系系統正式式用于實實際檢測測病人標標本之前前，實驗驗室必須須對檢測測系統的的分析靈靈敏度進進行建立立或確認認。確定定檢測系系統的可可報告低低限是最最重要的的分析性性能。通過本次次實驗研研究，乙乙型肝炎炎病毒表表面抗原原定量檢檢測試劑劑盒和表表面抗體體定量檢檢測試劑劑盒（時時間分辨辨免疫熒熒光分析析法）的的LLDD分別為為0.003566ng/mL和和0.5548 mIUU/mLL，BLLD分別別為0.2000 ngg/mLL和5.000mmIU/mL，FS分分別為00.2000 nng/mmL和5.000mmIU/mL，線性范范圍分別別為0.2000 ngg/mLL-3000nng/mmL和55.000 mIIU/mmL-112000 mIIU/mmL，并并均達到到中國藥藥品生物物制品檢檢定所檢檢定要求求。HBV標標志物的的檢測常常用于病病人的篩篩選和