1、精選優質文檔傾情為你奉上精選優質文檔傾情為你奉上專心專注專業專心專注專業精選優質文檔傾情為你奉上專心專注專業現代分析技術在生藥學中的應用姚 曉 (南京中醫藥大學藥學院 11碩（8） ,江蘇南京)摘要介紹色譜法、光譜法、核磁共振波譜、質譜及其聯用技術、DNA分子診斷技術、X射線衍射法等幾種現代分析方法在生藥學中的應用。關鍵詞生藥學；現代分析技術Application of modern analytical technology in PharmacognosyYAO Xiao (Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing

2、 ,China)AbstractApplication of modern analytical technology in Pharmacognosy are introduced in this paper, including chromatographic techniques, spectral techniques, nuclearmagnetic resonance (NMR),mass spectrometry(MS,GC-MS, LC-MS, CE-MS, ICP-MS),DNA fingerprint techniques,X-ray diffraction techniq

3、uesKey wordsPharmacognosy；modern analytical technology我們即將跨入21世紀,生命科學將對21世紀的科學發展產生重大影響,生藥學這一門研究生藥的古老學科將面臨新的挑戰。以儀器分析為主的分析技術,包括高效液相色譜、薄層色譜、氣相色譜、超臨界流體色譜、高效毛細管電泳、紅外光譜與拉曼光譜、原子吸收光譜、核磁共振、質譜及其聯用技術(氣質聯用、液質聯用、電感耦合等離子體-質譜)、DNA分子診斷技術、X射線衍射法等。伴隨著生物技術、計算機技術、聯用技術等新技術不斷滲入，并在生藥學科得到應用;圍繞全球從中藥中開發新藥研究熱點的興起,及我國中醫藥走向世界面臨

4、的困境,生藥學研究將以提高中藥材(原料藥)的質量和中藥新藥在國際市場上的競爭力為主要目的。我們將現代分析技術在生藥學中的應用展開討論,闡述現代分析技術在21世紀生藥學研究的新領域的運用。1色譜法色譜法是現代分離分析的一個重要方法,它主要包括薄層色譜、紙色譜法、氣相色譜、液相色譜、凝膠色譜、超臨界流體色譜、高效毛細管電泳等。色譜法是以其高超的分離能力特點,具有分離效率高、應用范圍廣、樣品用量少、靈敏度高、易于自動化。在中藥材和中成藥分析中已廣泛應用,成為中藥質量控制的基本方法。1.1薄層色譜薄層色譜法是將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上,成一均勻薄層,待點樣、展開后,與適宜的對照物按同法

5、在同板上所得的色譜圖作對比,并可用薄層掃描儀進行掃描。TLC操作簡單,具有分離、鑒定雙重功能,是中藥分析的常用手段。莫善列等建立喉舒寧片含量測定的薄層色譜掃描法,并用該法測定不同產地樣品中脫水穿心蓮內酯的含量15。馮彥琳等采用薄層色譜掃描測定刺五加注射液中紫丁香苷的含量16。1.2紙色譜法紙色譜法是一種分配色譜，可用于氨基酸、糖類等水溶性成分的分析。1.3氣相色譜法(GC)氣相色譜法(GC)是以氣體為流動相,分離效率高、樣品用量少、分析速度快。適用于分離、鑒別和定量測定揮發性成分。對于揮發性成分的中藥,多采用氣相色譜法鑒別和測定含量,在大孔吸附樹脂溶劑殘留檢測、中藥中農藥殘留的檢測也有大量的應

6、用。黃月純等采用程序升溫對10批石菖蒲中揮發油成分進行氣相色譜分析,共標出6個特征峰,建立石菖蒲揮發油的氣相指紋圖譜,控制其質量1。1.4高效液相色譜法(HPLC)HPLC是以液體溶劑作為流動相的色譜技術,有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高和分析速度快的特點。高效液相色譜法是一種非常有效并普遍實用的中藥分析方法,可用于高分子、極性、離子和熱不穩定性化合物的分離分析。劉永剛采用C18柱,梯度洗脫,建立藿香正氣水中橙皮苷、甘草苷、厚樸酚和厚樸酚含量的測定方法6。朱文良采用HPLC法,C18柱,檢測波長為203nm,同時測定復方黃芪注射液中人參皂苷Re、Rg1的含量7。1.5超臨界流體色譜超臨界流

7、體可以用作色譜的流動相,使混合物質在色譜柱上得到分離,這種分離方法被稱為超臨界流體色譜。超臨界流體對物質的溶解能力比一般氣體大的多,相當于有機溶劑,但比有機溶劑的擴散速度快、黏度低、表面張力小。超臨界流體溶解能力的大小隨其壓力的變化而改變。由于超臨界流體的黏度很低,SFC就可采用比高效液相色譜(HPLC)高的流速,因此具有分析/制備快的優點。SFC作為一種新的分離手段,對天然產物的分離純化有較大優勢,它既不破壞天然產物的活性,又可快速達到分離,是一種高效的分離和制備方法。王學軍等采用C18色譜柱,流動相為超臨界CO2-005%三氟乙酸的乙醇溶液 (101),檢測波長360nm,同時測定銀杏葉提

8、取物中槲皮素和蘆丁的含量21。1.6高效毛細管電泳(HPCE)高效毛細管電泳是以高壓電場為驅動力,毛細管為分離通道,依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的一類液相分離技術,具有分離效率高、速度快、所需樣品少、溶劑消耗少和抗污染能力強等特點。HPCE已經日益廣泛地應用于中藥生藥化學成分的分離、鑒別和含量測定,分析成分主要包括生物堿、黃酮、苷類、酚類、有機酸、香豆素、醌類及其它成分。吳江明等采用膠束毛細管電泳法同時測定黃連-吳茱萸藥對中小檗堿、巴馬汀、藥根堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿5種主要生物堿含量24。1.7凝膠電泳根據蛋白分子大小將其分離，經染色后通過譜帶的顏色深淺和數目，作為不

9、同中藥材的鑒別依據。適合于肽類、核酸、多糖等大分子化合物的分析鑒定。史克莉采用SDSPAGE電泳鑒別3種蜂王漿、金錢白花蛇、烏梢蛇、炮制前后的蝎子以及鹿蹄筋，該方法為動物類中藥鑒別提供可靠得鑒別特征【16】。2光譜法1.1可見一紫外分光光度法(UV)此方法原理是根據不同藥材的紫外吸收光譜互異這一特性進行鑒別。一般用于總提取物或部分提取物中某類成分的含量分析，也可通過導數光譜法進行混合物中單一組分的測定，或通過指紋圖譜進行定性分析。李同芬利用紫外光譜分析把柴胡、狹葉柴胡、大葉柴胡三者區分開1。湯迎爽根據子外吸收峰位置和數目的差異，鑒別了粉防己及其混淆品2。2.2紅外光譜與拉曼光譜紅外光譜和拉曼光

10、譜均屬于分子振動光譜,紅外光譜是有機分子的吸收光譜,而拉曼光譜是有機分子的散射光譜,二者都是利用有機物在低能量照射下分子發生振動的原理來提供結構信息,雖然二者基本原理有所不同,但所得信息均豐富而且能相互補充。可提供分子中有關官能團的內在信息, “指紋”區對異構體有選擇性,可進行定量及無損分析。許良等對止瀉子及其兩種混淆品的紅外光譜進行比較,從藥材的紅外光譜數據可知, 3種藥材各有獨特的紅外指紋特征,其各峰位及相對強度不同,說明3種藥材所含化學成分和各成分的相對含量不同,能夠快速鑒別蒙藥材止瀉子及其混淆品地梢瓜和連翹34。2.3原子吸收光譜(AAS)由待測元素燈發出的特征譜線通過供試品蒸氣時,被

11、蒸氣中待測元素的基態原子所吸收,吸收遵循一般分光光度法的吸收定律,通過測定輻射光強度減弱的程度可求出待測元素的含量。在中草藥無機微量元素含量分析上得到廣泛的應用。陳惠玲等采用火焰原子吸收光譜法,測定粗毛淫羊藿生品及3種不同炮制品中10種微量元素的含量并作比較40。3核磁共振波譜(NMR)核磁共振波譜是一種物理方法,它檢測的是組成有機化合物分子的原子核的性質及其周圍化學環境的相互作用。在適當的磁場條件下,樣品能夠吸收射頻區的電磁輻射,所吸收的輻射頻率取決于樣品的特性,吸收與分子中的某一給定的原子核有關,吸收峰頻率對吸收峰強度作圖構成NMR譜圖。自1946年發現核磁共振現象以來,NMR儀器和方法迅

12、猛發展,二維(2D)和多維NMR技術的發展就是一個突出的例子。NMR主要應用領域是測定分子的結構,中藥基礎研究的關鍵問題之一就是中藥治療疾病的物質基礎研究,研究中藥治療疾病的物質基礎,首先就要研究清楚中藥有效成分的化學結構,這已經成為中藥現代化的關鍵內容。張慶英等利用現代1D-和2D-NMR技術對aromoline(崖藤中生物堿)的1H-NMR和13C-NMR數據進行正確全歸屬,并報道該化合物的CD譜44。4質譜及其聯用技術質譜分析是通過對樣品離子的質量和強度的測定,來進行化學成分和結構分析的一種分析方法。有機質譜能夠給出有機化合物的分子量、分子式,分子離子和碎片離子、碎片離子和碎片離子之間的

13、生緣關系,以及揭示生成碎片離子的裂解方式和有機分子結構類型關系的規律性。主要用于中草藥及植物的化學成分的化學結構鑒定和測定。色譜聯用技術的出現加快中藥研發的步伐,該技術具有所需樣品量少、速度快等特點,且可得到更多信息,目前,正處于快速發展階段并廣泛應用的色譜聯用技術包括氣相色譜/質譜聯用(GC-MS)、液相色譜/質譜聯用 (LC/MS)、液相色譜/質譜/質譜聯用(LC/MS/MS)、毛細管電泳/質譜聯用(CE/MS)、電感耦合等離子體/質譜聯用(ICP-MS)等。4.1質譜應用竇建鵬等采用電噴霧多級串聯質譜(ESI-MS)技術,對從朝鮮淫羊藿分離得到的組分A、組分B分別進行指認,確定它們的化學

14、成分,并系統研究其質譜碎裂規律與結構之間的關系,為快速鑒定這兩種化合物提供一種新方法50。4.2氣質聯用技術應用(GC-MS)魏剛探討GC-MS建立中藥特征指紋圖譜色譜條件的參數設置,建議采用特征指標成分群開展方法學(精密度、穩定性、重現性)的考察,且將相對含量的RSD值定為不得大于5%比較符合實際情況52。4.3液質聯用技術應用(LC-MS)張潔等對HPLC-ESI-MS/MS條件進行優化,研究紫杉醇電噴霧質譜的一級電離規律和二級質譜裂解規律,并結合液相色譜的保留時間判斷東北紅豆杉及其傷愈組織粗提物中紫杉醇色譜峰的歸屬56。周欣等研究用液相色譜-電噴霧質譜聯用技術定量測定銀杏內酯A, B,

15、C和白果內酯BB的方法57。4.4毛細管電泳/質譜聯用技術應用(CE /MS)柳仁民等以非水毛細管電泳對粉防己甲醇提取物中的生物堿進行分離,并利用在線電噴霧離子阱質譜得到的準分子離子及碎片信息對其進行鑒定;使用未涂層毛細管, 50mmo1L-1醋酸銨-4%HAc-甲醇溶液為運行緩沖液,分離電壓為25kV,質譜接口為同軸鞘液接口;電噴霧電壓為45kv,鋁毛細管溫度為170;鞘液組成為60%異丙醇-39%水-%lHAc,鞘液流速為5Lmin-161。4.5電感耦合等離子體/質譜應用( ICP-MS)電感耦合等離子體-質譜技術是20世紀80年代發展起來的新型的元素和同位素分析技術。與傳統的元素分析技

16、術相比, ICP-MS技術提供極低的檢出限,極寬的動態線性范圍、干擾少、分析精密度高、分析速度快、可提供同位素信息。它在分析能力上可取代傳統的石墨爐原子吸收、電感耦合等離子體光譜技術,已廣泛應用于環境、半導體、生物醫藥分析等領域。夏斌鋒等使用電感耦合等離子體質譜儀測定西洋參、丹參等10個品種藥材中的銅、砷、鎘、汞、鉛,數據的重復性和回收率符合痕量分析要求62。5 X射線衍射法X衍射技術是一種研究物質的物相和晶體結構的分析方法，被廣泛應用于生產、科研等領域，在中藥鑒定中的應用也日益廣泛。其應用原理是當X射線通過晶體時，可以產生衍射效應，在空間形成一幅由不同晶面產生的衍射線構成的圖譜，圖譜包含了反

17、映晶體空間結構的信息(Fourier變換)，通過計算(Fourier反變換)可獲得晶體分子精確的三維立體結構。如果被測定物質是混合物，所得的應是各組分衍射效應的疊加，故只要成分恒定，圖譜也就恒定。中藥粉末X衍射圖譜是其所含全部成分的一次Fourier變換，它與所含化學成分呈一一對應的關系。因此，可通過X衍射Fourier譜分析，獲得每種中藥特定的X衍射圖譜，實現對中藥的鑒定34。在中藥鑒定中的應用主要有以下幾方面。5.1在植物類中藥中的應用周俊國等5對3種不同產地12個樣品的蛇床子進行粉末X射線衍射分析，結果表明，不同產地蛇床子衍射圖譜按其幾何拓撲大致可分為4類相似的衍射模糊圖形，與TCL法分

18、析的結果一致，為中藥鑒定提供了新的譜學分析依據。5.2在動物類中藥中的應用李蘭燕等6采用粉末X射線衍射Fourier譜鑒定法，對1個廣地龍藥材對照品、4個廣地龍中藥材進行實驗分析，結果得到了其標準X射線衍射Fourier圖譜及特征標記峰值。結果表明5個廣地龍樣品的X射線衍Fourier圖譜幾何拓撲圖形規律是一致的。5.3在礦物類中藥中的應用古令等7分析了8種馬寶和一種偽馬寶的成分，證明了正品和偽品的化學成分完全不同。5.4在菌類中藥中的應用X射線衍射法同樣已在菌類中藥中得到了應用。如羅俊等8報道，采用波譜和X射線衍射分析赤芝子實體的化學結構，分離得到4個化合物，鑒定為麥角甾醇、麥角甾-7，22

19、-二烯-3-醇和兩個新化合物。6 計算機模式分類技術原理是采用先進的色譜和光譜分析進行化學量測，從中獲取中藥質量優劣的化學信息，用計算機模式分類技術進行分類決策，依此來鑒定中藥。不同的中藥樣品在化學成分及含量上存在著差異，可用色譜和光譜等反映出來，并將從色譜、光譜中提取的有用信息特征轉化為計算機能夠接受n行m列數量化矩陣，屬于不同類別的樣品則相互分離。主要的計算機模式分類技術有K最近鄰分類法(KNN)、非線形映照法(NLM)、主成分分析法(PCA)、SIMC法、PRIMA法、星區圖法、模糊聚類分析法、人工神經網絡法等。計算機模式技術用于中藥鑒定與當前國家對中藥質量現代化研究的宏觀要求相吻合。蘇

20、薇薇從5種黃芬的薄層色譜中獲取分類特征，用模糊聚類分析法準確的區分了藥典規定的正品黃琴與4種非正品黃芬在所含化學成分上差異的大小19。7 分子生物技術傳統的中藥鑒別主要依據形態學特征和理化性質，但是最具有決定意義的應該是DNA鑒定，因為物種的差異歸根結底是由于它們DNA之間的核酸序列不同，中藥的DNA鑒定即中藥的DNA指紋圖構建，通過對中藥品種基因組的直接分析，不僅有助于正本清源，而且對于建立我國一些地道名貴中藥材的基因庫，了解這些品種的遺傳變遷狀況及代用品間血緣關系遠近都有重大意義?？蓱糜谒幱弥参镨b別的分子生物學方法主要有:限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)

21、、擴增片段長度多態性(AFLP)、隨機引物PCR(AP一PCR)、DNA指紋技術(DAF)和生物芯片術等。7.1限制性片段多態性(RFLP) 限制性片段多態性(RFLP)是依據不同植物個體來源的DNA所形成的不同的譜帶模型與低拷貝的DNA探針雜交得到DNA的限制性片段多態性，它代表的是基因組DNA在限制性內切酶消化后產生的片段在長度上的差異。其結果穩定可靠，重復性好，但是操作復雜，費用高，易造成污染，應用較少。張婷利用PCRRFLP成功鑒定了25件市售束花石、解、流蘇石解及其形態相似種21。7.2隨機擴增多態性DNA(RAPD) 隨機擴增多態性DNA(RAPD)原理是根據DNA聚合酶鏈反應技術

22、(PCR)，采用人工合成的隨機引物，以植物組織分離的基因組DNA為模板，進行多態性DNA片段的隨機合成反應，從而根據DNA片段，將植物不同基因組予以區別。張艷波等收集了6種拘祀屬植物，7個正品，4個混淆品，運用RAPD技術，獲得了構祀屬不同種植物的DNA指紋圖譜，為構祀地道品種鑒別提供分子水平的依據。曹暉采用任意引物聚合酶鏈反應和隨意引物擴增的多態性DNA方法，擴增蒲公英及其6種土公英混淆品的基因組DNA，獲得清晰并可靠的DNA指紋圖譜，根據瓊脂糖凝膠上顯示的DNA帶型差異可鑒別蒲公英及其混淆品22。7.3擴增片段長度多態性(AFLP)擴增片段長度多態性(AFLP)是RFLP和RAPD兩種技術

23、相結合的一種分子標記技術，既有RFLP的專一性、可靠性，又有RAPD技術的隨機性、方便性。YamaZaki利用AFLP鑒別甘草屬植物23。7.4 DNA測序法以PCR擴增產物作為測序引物，提高了DNA序列分析的效率。馬小軍通過比較不同人參的ITS序列進行鑒別24。7.5生物芯片生物芯片是將大量探針分子(DNA，RNA或多肽)固定在支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，對樣品分子進行定性、定量和結構分析。李紹平采用生物芯片鑒定川貝母25。8 結語本文對現代分析技術在生藥分析中應用作了簡要綜述與分析。由每種技術各有優缺點和適用對象，故在生藥分析的實際應用中可從材料

24、特點、實驗條件和已有的研究基礎出發，選擇一種或幾種方法，以找出快速有效、經濟穩定的實用基因技術以分析生藥。相信隨著PCR，DNA測序，核昔酸引物合成、核酸內切酶分離純化等技術向低成本商業化(試劑盒)、高效率自動化(分析儀器)方向發展，不久的將來以內切酸探針和引物探針為代表的基因技術PCR分析法有可能成為繼顯微、理化方法之后生藥分析領域又一常規分子分析方法。應用此方法只要選擇特異的探針通過PCR擴增或酶解，電泳分離即可達到生藥分析目的。參考文獻 1李萍，徐國鈞，徐珞珊.21世紀生藥學研究展望J. 中國藥學雜志，1997， 32（9）5135172黃月純,魏剛.石菖蒲揮發油的氣相色譜指紋圖譜研究J

25、.中國藥房, 2005, 16(21) 166616773莫善列,思秀玲,韋松.薄層掃描法測定喉舒寧片中脫水穿心蓮內酯的含量J.中成藥, 2005, 27(12) 1481 14824馮彥琳,李美萍,李俊.薄層色譜掃描法測定刺五加注射液中紫丁香苷的含量J.藥物分析雜志, 2006, 26(6) 8538545劉永剛,盧建秋,劉珍清，等.高效液相色譜法測定藿香正氣水中橙皮苷等4種成分的含量J.時珍國醫國藥, 2006, 17(10) 194719486朱文良,李發美.HPLC法同時測定復方黃芪注射液中人參皂苷Re、Rg1含量, 2006, 23(9) 5775807王學軍,許振良,趙鎖奇.銀杏葉

26、提取物中槲皮素和蘆丁的超臨界流體色譜法測定J.中國醫藥工業雜志, 2005, 36(7) 415418吳江明,欒連軍,程翼宇.膠束毛細管電泳法同時測定黃連-吳茱萸藥對5種生物堿的含量J.藥物分析雜志, 2006, 26(3)3253289史克莉等.幾種動物類中藥材SDS的電泳鑒別J.中成藥.2004, (5) 41110李同芬等.北柴胡、南柴胡與大葉柴胡紫外光譜及導數光譜指紋鑒別J.中草藥.1990: (3) 3111湯迎爽等.紫外光譜法鑒別粉防己及其混淆品木防己、小果微花藤J.時珍國醫國藥.2003, (1) 2612許良,王志民,吳香杰等.止瀉子及其混淆品的傅立葉變換紅外光譜法鑒別J.時珍

27、國醫國藥, 2006, 17(1)798013陳惠玲,王建科,任永全等.粗毛淫羊藿及其不同炮制品中10種微量元素的含量J.中國中藥雜志, 2001, 26(3)15916114張慶英,梁鴻,蔡少青,等.崖藤中生物堿aromoline的結構及NMR研究J.中草藥, 2005, 36(11)1627162915竇建鵬,劉志強,劉淑瑩.兩種黃酮醇苷同分異構體的電噴霧質譜區分N.質譜學報, 2004, 25(增刊)535416魏剛.氣相色譜-質譜聯用建立中藥特征指紋圖譜的色譜條件探討J.時珍國醫國藥, 2005, 16(8)72872917張潔,段繼誠,梁振,等.東北紅豆杉及其傷愈組織粗提物中紫杉醇HPLC-ESI-MS/MS分析研究N.藥學學報, 2006, 41 (9)8