1、名詞解釋10*2是非10*2選擇10*2簡(jiǎn)答5*5論述1*15 18日14:00-16:00教 2101基因工程：是指核酸分子經(jīng)體外加工，將不同來(lái)源的基因按照設(shè)計(jì)組成新的基 因組，再把它引入宿主細(xì)胞中，使之表示的技術(shù)。簡(jiǎn)單地能夠歸結(jié)為：經(jīng)過(guò)體外 基因操作，引起生物遺傳性狀改變的技術(shù)。基因工程應(yīng)用在植物方面的就稱為植 物基因工程。載體：把一個(gè)有用的目的基因DNA片段經(jīng)過(guò)重組DNA技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn) 行繁殖和表示的工具叫載體。當(dāng)前使用的載體主要有四大類：質(zhì)粒，噬菌體入、 單鏈?zhǔn)删w和粘粒。質(zhì)粒的拷貝數(shù)：指質(zhì)粒在復(fù)制時(shí)與宿主的繁殖相結(jié)合，致使每個(gè)細(xì)胞中只有一 個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒，質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)

2、為10200個(gè)。轉(zhuǎn)化：是指將外源DNA引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它 是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。感受態(tài)細(xì)胞：是指具有吸收裸DNA分子能力的細(xì)胞，一般經(jīng)一系列的處理方式 可使得細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，而使細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。受體細(xì)胞：是指轉(zhuǎn)化的對(duì)象，接受重組DNA的細(xì)胞，一般要求有高轉(zhuǎn)化率，能 保持質(zhì)粒穩(wěn)定，屬某營(yíng)養(yǎng)缺陷型，具其它選擇標(biāo)記等條件。基因組文庫(kù)：是指把某種細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA,按一定長(zhǎng)短要求，酶解成若 干片段，在與合適的載體分子重組，引入相應(yīng)細(xì)胞，形成一大批含重組DNA分 子的細(xì)胞克隆群體，該克隆群體即為基因組文庫(kù)。cDNA文庫(kù)：是指以

3、生物體的RNA（一般是mRNA）為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA分子, 予以克隆形成的一種基因文庫(kù)。S-D序列：細(xì)菌mRNA翻譯起點(diǎn)上游與16SrRNA相結(jié)合的序列。退火：是指PCR等核酸分子重組過(guò)程中，即DNA加熱變性后逐漸冷卻的過(guò)程，在 分子遺傳中，應(yīng)用于不同來(lái)源的核酸分子形成雜合體的研究中。轉(zhuǎn)化外源基因的穩(wěn)定表示:是指外源基因整合到核基因組DNA分子上，并能穩(wěn)定 遺傳的外源基因的表示。分子標(biāo)記:可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白。包括蛋白質(zhì)標(biāo)記和DNA標(biāo)記。轉(zhuǎn)座子基因工程的研究?jī)?nèi)容1、特定目的基因的分離或合成2 .構(gòu)建重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞篩選重組DNA菌落目的基因的有效表示基因工程的基

4、本操作程序主要包括五個(gè)方面的內(nèi)容：1帶有目的基因的DNA片段的制備、DNA片段與載體DNA體外重組2、DNA重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞3、4重組體克隆的篩選與鑒定4、5外源基因的表示、制備外源DNA片段能夠有以下5個(gè)途徑：第一從生物基因組群體中分離目的基因（鳥槍法即限制性內(nèi)切酶法、反轉(zhuǎn)錄第 ，法）第二，人工合成第三，PCR反應(yīng)合成DNA第四 mRNA差異顯示法獲得目的基因第四，第五機(jī)械的方法如超聲波把基因組打成片段。第五，工具酶：基因工程中進(jìn)行基因的剪切、拼接、組合所需的酶統(tǒng)稱為工具酶工具酶按功能分為剪切酶、修飾酶、連接酶限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：只降解雙鏈DNA分子，而不切單鏈DNA,反應(yīng)時(shí)需金屬M(fèi)g2+

5、離子等。影響限制性內(nèi)切酶活性的主要因素:1酶的純度 .4.酶切反應(yīng)的溫度與時(shí)間2 DNA樣品的純度 2.5.DNA分子的構(gòu)型3 DNA的甲基化程度 3.6.反應(yīng)緩沖液常見的聚合酶有三種：即依賴DNA的DNA聚合酶；依賴RNA的DNA聚合酶；依賴DNA的RNA聚合酶。理想的基因工程載體的要求:1.能在受體細(xì)胞中獨(dú)立繁殖4.分子量小，多拷貝易于分離、純2.容易導(dǎo)入受體細(xì)胞化、導(dǎo)入有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)5.有容易識(shí)別的篩選標(biāo)記,載體的種類：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、粘粒質(zhì)粒的三種構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA( cccDNA)、開環(huán)DNA( ocDNA)、線形DNA( LDNA) 質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率：同一質(zhì)粒盡

6、管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率 不同 電泳順序(快到慢)1 SC 2L 3 OC為什么要質(zhì)粒質(zhì)粒載體的構(gòu)建?1、天然質(zhì)粒的局限性分子量大，拷貝數(shù)低篩選標(biāo)志不理想質(zhì)粒載體必須具備的基本條件(1)具有復(fù)制起點(diǎn)(ORI)(4)具有較小的分子質(zhì)量和較高的拷(2)具有抗菌素抗性基因貝數(shù)若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)質(zhì)粒載體是以PBR322為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建的PBR322的優(yōu)點(diǎn)1）雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記沒有獲得載體的寄主細(xì)胞，在Amp或Tet中都死亡獲得載體的寄主細(xì)胞，在Amp或Tet其中之一中死亡2）分子小，克隆能力大載體越小越好，大于10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂3）高拷貝數(shù)4）安全粘粒載體的特點(diǎn)：具

7、有l(wèi)噬菌體的特性，在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNA具有質(zhì)粒載體的特性，能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。方便的選擇高容量的克隆能力大分子DNA克隆載體：一、酵母人工染色體YACYAC載體的基因結(jié)構(gòu) 著絲粒區(qū)（CEN）主管染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中正確地分配到子細(xì)胞 中 端粒（TEL）對(duì)于染色體的穩(wěn)定及端粒復(fù)制具有重要意義 復(fù)制起點(diǎn)（ORI）YAC可容納更長(zhǎng)的DNA片段，用較少的克隆就能夠包含特定的基因組全部序列并 由此保持基因特定的完整性，有利于制作物理圖譜。構(gòu)建時(shí)在細(xì)菌中操作。細(xì)菌人工染色體（BAC）是以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建的細(xì)菌克隆載體。F質(zhì)粒的特點(diǎn)：1）單拷貝復(fù)制2）克隆容量可達(dá)300kb3）比較穩(wěn)定4）便于提純

8、核酸的提取與純化的三大步驟:1細(xì)胞破碎 2去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及多糖脂等雜質(zhì)，3除去其它雜質(zhì)核酸CTAB法是種去污劑,可溶解細(xì)胞膜，與核酸結(jié)合形成復(fù)合物,在高鹽溶液中可溶， 低鹽濃度時(shí)可沉淀，經(jīng)過(guò)離心將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)多糖類物質(zhì)分開, 然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB 溶于乙醇.SDS法的基本原理：利用高濃度SDS在較高溫度（ 55-65C）條件下裂解細(xì)胞， 使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后用提高鹽濃度及降低溫度的做 法使蛋白質(zhì)及多糖沉淀（一般是加入5M的乙酸鉀于冰上保溫，在低溫條件下乙 酸鉀與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物）。

9、離心除去沉淀后，對(duì)上清液中的核酸進(jìn)行 重復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，用乙醇沉淀水相中的核酸。方法：CTAB法、異硫氫酸胍、Trizol法RNA提取的關(guān)鍵因素是盡量減少的污染。并設(shè)法抑制RNA酶的活性。 污染來(lái)源：所有的器皿、所用的溶液、實(shí)驗(yàn)人員的手及飛沫。核酸的凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳與聚丙烯酰胺凝膠電泳的區(qū)別：聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高聚丙烯酰胺凝膠比瓊脂糖凝膠的載樣量大，聚丙烯酰胺凝膠回收的DNA樣品純度極高可用于要求非常嚴(yán)格的試驗(yàn)在聚丙烯酰胺凝膠分子的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，帶有酰胺側(cè)鏈的C-C聚合物不帶 或少帶離子側(cè)鏈基團(tuán)聚丙烯酰胺凝膠無(wú)色透明，比瓊脂糖凝膠的紫外線吸收

10、率低，抗腐蝕性強(qiáng)， 機(jī)械強(qiáng)度高，韌性好影響凝膠電泳的因素：酶切效果即DNA分子大小：分子量大的，DNA遷移率小DNA分子構(gòu)象：線性分子與環(huán)狀DNA分子的遷移率不同DNA分子所帶的電荷數(shù)：所帶電荷數(shù)多，遷移快緩沖液的極性所采用電壓的大小染色劑的添加量凝膠的濃度和厚度Southern印跡雜交：DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用 探針進(jìn)行檢測(cè)的方法。Northern印跡雜交：檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同_靶核酸：RNA_ RNA電泳_轉(zhuǎn)膜：不需變性Western雜交印跡法：檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相 載體上，用特異的抗血

11、清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法。探針：指經(jīng)放射性或非放射性等物質(zhì)標(biāo)記的已知或特定的DNA或RNA序列。根據(jù)探針的來(lái)源及核酸性質(zhì)不同：DNA探針、RNA探針、cDNA探針，及寡核苷 酸探針探針的標(biāo)記方法：（1） DNA缺口平移法（2） DNA隨機(jī)引物法（3）聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記法 構(gòu)建基因文庫(kù)所使用的載體主要有：入噬菌體、粘粒（菌落）、質(zhì)粒、酵母人 工染色體基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的區(qū)別：從定義上看，基因組文庫(kù)指某種細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因組按一定長(zhǎng)短要求被酶 切成若干片段，與合適的載體分子重組，引入相應(yīng)的細(xì)胞，形成的一大批含 DNA重組體的細(xì)胞克隆群體，這樣的細(xì)胞克隆群體稱為基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)指以生物

12、體RNA 一般是mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用形成cDNA 再予以克隆而形成的一種基因文庫(kù)。就真核生物的基因而言，mRNA前體經(jīng)加工，去除內(nèi)含子，且加尾polyA成 為成熟mRNA,故cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)對(duì)照可用于研究?jī)?nèi)含子在基因中的位置 及功能。PCR的原理：PCR是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外的基因擴(kuò)增。其原理是在一種 高溫DNA聚合酶的作用下經(jīng)過(guò)引物的模板DNA的作用來(lái)擴(kuò)增DNA。模板能夠是基 因組D NA,單鏈D NA,克隆的D NA序列或RNA（經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄成cDNA）。PCR的三個(gè)基本反應(yīng)步驟:變性一退火一延伸模板DNA的變性：加熱變性，使DNA雙鏈解離為單鏈，以便它與引物結(jié)合， 為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)