1、復方二精靈多糖抗腦缺血缺氧損傷的分子機理【關鍵詞】復方二精靈摘要：目的：研究復方二精靈多糖抗腦缺血損傷的分子機理。方法：采用全細胞膜片鉗技術記錄急性別離的小鼠海馬A1區神經元電壓門控性鈉電流，觀察復方二精靈多糖對鈉電流的影響，擬從離子通道程度提醒復方二精靈的抗缺血缺氧腦損傷作用。結果：0.1%復方二精靈多糖顯著抑制海馬神經元電壓門控性鈉通道電流鋒值，使鈉電流的半激活電壓向去極化方向偏移，不影響鈉電流的穩態失活及復活曲線。結論：復方二精靈多糖對海馬神經元電壓門控性鈉電流的抑制作用可能為復方二精靈抗缺血缺氧腦損傷的重要機理。關鍵詞：復方二精靈；海馬神經元；電壓門控性鈉通道Theleularehan

2、isfpundErjinglingPlysaharideNeurprtetinEffetnHypxiaandIsheiaDaageAbstrat:Usinghleellpathlaptehnlgyntheebraneffreshlyislatedhippapalneurns,theeffetsfpundErjinglingplysaharidenvltagegatedsdiuurrentserebservedtinvestigateitsleularehanisfneurprtetininhypxiaandisheiadaage.Theexperientaldatadenstratedthat

3、peaksdiuurrentsfhippapalneurnsdereasedsignifiantlyafterappliatinf0.1%pundErjinglingplysaharide(fr100%t60.9612.13%,n=16，P0.05).Thehalf-axiuativatinvltagefINashiftedfr29.984.30Vt15.852.9Vafteradinistering0.1%pundErjingling(n=6,P0.05).TheinhibitineffetsfpundErjinglingplysaharidensdiuurrentsinhippapalne

4、urnsuldpartlyexplaintheneurprtetinfpundErjinglinginhypxiaandisheiadaage.Keyrds:pundErjinglingplysaharide；vltagegatedsdiuhannel；Hippapalneurn復方二精靈是由枸杞子FrutusLyii和黃精RhizefKingSlseal組成，最早收載于?圣濟總錄?，具有“助氣固精，補填丹田，活血駐顏，長生不老之成效。現代研究證實復方二精靈可拮抗谷氨酸對離體培養神經細胞的興奮性毒作用，明顯降低缺血缺氧小鼠腦組織乳酸含量，使海馬細胞變性及腫脹程度減輕，從而改善擬癡呆小鼠的學習記

5、憶才能1。復方二精靈成分復雜，種種跡象說明復方二精靈中的黃精多糖2和枸杞多糖3是其抗缺血缺氧腦損傷的重要活性部位，但因缺乏分子程度的合理解釋，制約了復方二精靈的臨床使用。由于缺血缺氧過程中神經細胞變性損害與神經細胞膜上電壓門控性鈉通道介導的鈉離子內流增強有關4，多種藥物正是通過阻滯神經細胞膜上電壓門控性鈉通道而發揮腦保護作用5，6。在所有腦神經元中，海馬神經元對缺血缺氧最為敏感7，海馬組織也是學習記憶功能的關鍵腦區8，能否有效減輕海馬神經元損傷成為缺血缺氧過程中腦保護的關鍵。鑒于此，本研究主要觀察復方二精靈多糖對急性別離的小鼠海馬神經元電壓門控性鈉通道的影響作用，擬從分子程度提醒其在缺血缺氧過

6、程中的腦保護作用。1材料與方法1.1復方二精靈多糖的制備取黃精和枸杞各50g，混勻。依次用5倍體積石油醚-丙酮V/V11回流脫脂，5倍體積80乙醇(V/V)脫單糖、低聚糖等雜質，然后用1000l熱水提取3次，水提取液合并，60減壓濃縮至1.5倍體積，濃縮液以95乙醇沉淀，至乙醇濃度為80，沉淀2次，沉淀物依次用95乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌脫水，60真空枯燥得粗多糖7.30g。復方二精靈多糖含量用硫酸-苯酚法490n處檢測，其含量為80.8。1.2海馬神經元的急性別離一月齡昆明種小鼠1520g，武漢大學實驗動物中心提供頸椎脫臼處死，斷頭取腦于4的D-hanks液中冷凍1in后移入氧飽和的ASF液

7、中別離雙側海馬。在32的恒溫水浴搖床中孵育海馬40in后參加0.2/l鏈酶蛋白酶E(prtease,Siga)消化20in，在解剖顯微鏡下用細解剖針將海馬1區分割下來并移入氧飽和的DE/F12培養液中，用尖端熱拋光處理的吸管(口徑依次為500，300和150)將之吹打成細胞懸液。將細胞懸液經200目篩網過濾至直徑35的培養皿內，待細胞貼壁后更換外液兩次，行全細胞膜片鉗記錄。實驗在室溫2225范圍內進展。1.3記錄液及實驗用藥記錄海馬神經元電壓門控性鈉通道電流的細胞外液成分為(l/L)：Nal145.0；Kl5.0；al22.0；gl21.0；HEPES10.0；DGluse10.0；4AP1.

8、0；l-TEA20.0，pH7.4。記錄鈉通道電流的細胞內液成分為l/L：sl100.0；KF40.0；al21.0；gl22.0；EGTA10.0；HEPES10.0；Na2ATP5.0；lTEA20.0，pH7.2。以上所用藥物中4AP，EGTA，HEPES，lTEA及Na2ATP為Siga公司產品，其它為國產分析純。實驗過程中所用藥物復方二精靈多糖用細胞外液配制成0.1%的濃度。1.4全細胞膜片鉗記錄應用EP9雙通道膜片鉗放大器HEKA公司，Gerany行全細胞膜片鉗記錄。僅選用形態為錐形或梭形、有頂樹突和基樹突特征的錐體細胞進展全細胞膜片鉗記錄觀察鈉通道電流。在電極與細胞膜之間形成高阻

9、(15G)封接后，負壓破膜，并給予適當的電容補償，在設定的刺激電壓下，觀察鈉電流的激活情況。先觀察正常鈉電流，再經DAD給藥系統ALA，USA向細胞噴射0.1%的復方二精靈多糖，記錄給藥后的鈉通道電流。1.5實驗資料的處理實驗資料經plusefit軟件及IGR軟件進展分析處理，實驗數據用s表示。對各組數據分別進展t檢驗，以P0.05作為顯著性檢驗的標準。2結果2.1復方二精靈多糖對海馬神經元電壓門控性鈉通道鋒電流的影響在90V的鉗制電位下，從60V起給予10V步幅遞增、80s步寬的去極化脈沖刺激至+60V，分別激活并記錄給藥前后海馬神經元鈉通道電流。本研究以單純的外液沖洗對海馬神經元電壓門控性

10、鈉電流的影響為對照，考察0.1%復方二精靈多糖給藥前后海馬細胞鈉通道電流峰值的改變情況。詳細做法是設置外液沖洗給藥前鈉電流峰值為100%，按照公式沖洗給藥后Iax/沖洗給藥前Iax100%對外液沖洗給藥后所記錄的海馬細胞鈉電流峰值進展標準化。結果發現單純外液沖洗即刻使海馬細胞鈉電流峰值略微增加至沖洗前的(111.6214.35)%，而0.1%復方二精靈多糖給藥即刻使海馬細胞鈉電流峰值明顯減少至給藥前的(60.9612.13)%。與單純的外液沖洗相比，0.1%復方二精靈多糖給藥即刻顯著抑制海馬細胞鈉電流峰值(n=16，P0.05)。轉貼于論文聯盟.ll.2.2復方二精靈多糖對海馬神經元電壓門控性

11、鈉通道激活、失活及復活動力學特性的影響將膜電位鉗制在90V，從60V起給予10V步幅遞增、80s步寬的去極化脈沖刺激至+60V，引出鈉通道電流(圖2A)。以測試電壓為橫軸，測試電壓所對應的標準化電流值為縱軸，繪制給藥前后電流的穩態激活曲線，鈉電流的穩態激活曲線用Bltzann方程擬合得出海馬神經元鈉通道給藥前后的半激活電壓值(1/2)：I/Iax=1/1+exp(V-V1/2)/k。(表示測試電壓所對應的鈉電流峰值，1/2表示50最大激活時所對應的測試電壓,k為曲線的斜率)。結果說明0.1%的復方二精靈多糖顯著改變了海馬神經元穩態激活曲線圖2a，使半激活電壓由給藥前的(29.984.30)V去

12、極化偏移至(15.852.9)VP0.05,n=16。將膜電位鉗制在90V，采用雙脈沖刺激方法觀察鈉通道的穩態失活情況，即先給予10V步幅遞增、30s步寬、90V-20V的條件刺激電壓，每一條件刺激后緊跟一30s步寬、20V的測試電壓刺激(圖2b)。以測試電壓所激活的標準化鈉電流峰值I/Iax對條件刺激電壓作圖繪制穩態失活曲線，也用Bltzann方程擬合得出海馬神經元鈉通道給藥前后的半失活電壓值(1/2)：I/Iax=1/1+exp(V-V1/2)/k。(表示測試電壓所對應的鈉電流峰值，1/2表示50最大激活時所對應的測試電壓,k為曲線的斜率)。結果發現，0.1%的復方二精靈多糖給藥前后海馬神

13、經元穩態失活曲線沒有明顯改變(55.420.75)Vvs(53.520.88)V,P0.05,n=6)圖2b。將膜電位鉗制在90V，采用雙脈沖刺激方法觀察鈉通道失活后的恢復情況，即在每一條件刺激電壓后都施加一測試電壓刺激，條件刺激電壓和測試電壓的寬度均為30s，兩次刺激的時間間隔從2s開場，以2s等差遞增至36s，條件刺激電壓和測試電壓均為20VFig2。以測試電壓所激活的標準化鈉電流峰值I/Iax對時間間隔t作圖繪制失活后的恢復曲線，并用單指數函數擬合曲線，得出鈉通道給藥前后失活后恢復的時間常數：I(t)/Iax=A0+A1et。t為條件刺激電壓和測試電壓之間的時間間隔，I(t)表示測試電壓

14、所對應的鈉電流峰值，為失活后恢復的時間常數。結果發現，0.1%的復方二精靈多糖給藥前后海馬神經元穩態復活曲線沒有明顯改變(圖2)，給藥前半復活時間常數為(6.210.27)s，給藥后為(7.380.42)sP0.05,n=6。3討論海馬組織是哺乳動物學習記憶形成的關鍵腦區，也是缺血缺氧易損區域，海馬組織的損害會引起學習和記憶功能受損7，8。目前認為細胞內鈣離子濃度的增加是急性腦缺血缺氧引起海馬細胞死亡的重要原因9，因為細胞質內a2+濃度的增高,可繼發線粒體內鈣積聚，繼而可出現線粒體膜通透性增加，大量氧自由基產生并釋放，最終線粒體損壞致細胞能量供給障礙，引起細胞死亡10。導致缺血缺氧時神經細胞內

15、鈣濃度增加的原因很多，而其中神經細胞膜電壓依賴性鈉通道介導的鈉內流增強與細胞內鈣超載關系尤為親密，鈉內流增強引起細胞內鈉離子濃度升高，細胞膜及線粒體膜上Na+/a2+交換相應增強，導致細胞質中游離a2+的增加4。正因為神經細胞膜上電壓門控性鈉通道在缺血缺氧時細胞內鈣超載發生中的重要地位，大量的研究工作也試圖去證實鈉通道阻滯藥在腦缺血缺氧過程中的神經保護作用。實際上多種藥物也正是通過阻滯神經細胞膜上電壓門控性鈉通道而發揮缺血缺氧過程中的腦保護作用的510。所以阻斷+通道是近年抗腦缺血缺氧損傷藥物研發中的一個研究熱點。黃精和枸杞為祖傳名貴益智中藥。現代藥理學實驗也證實了黃精11、枸杞12具有良好的

16、抗衰老、改善癡呆病癥的作用。黃精、枸杞的益智作用與其在缺血缺氧過程中的腦保護作用有關13，14，其中黃精多糖和枸杞多糖是它們抗缺血缺氧損傷的重要活性部位2，3。復方二精靈為等量黃精、枸杞配伍提取而成，最近的研究報道指出復方二精靈對體內外缺血缺氧損傷模型中的神經細胞均有明顯的保護與改善作用，這可能是復方二精靈改善學習記憶的重要原因1。然而復方二精靈在腦缺血缺氧過程中的神經保護作用尚缺乏分子程度的合理解釋，制約了該藥的臨床應用。考慮到在復方二精靈的多種組分中，黃精多糖和枸杞多糖是其抗缺血缺氧腦損傷的重要活性部位，本研究利用現代膜片鉗實驗技術，在急性別離的小鼠海馬細胞膜上觀察了復方二精靈多糖對電壓門

17、控性鈉通道的影響。結果發現復方二精靈多糖可顯著抑制急性別離的海馬神經元電壓門控性鈉通道電流鋒值，使鈉通道半激活電壓向去極化方向偏移。根據本實驗研究結果結合其他的研究報道，本課題組認為復方二精靈改善急性腦缺血缺氧所致記憶障礙的機理之一為其多糖組分抑制海馬細胞電壓門控性鈉通道，有效阻止了海馬細胞內鈣積聚，在一定程度上減弱了海馬細胞內鈣超載所致海馬細胞損傷。由于本研究所使用的藥品為復方二精靈的多糖組分，其對海馬細胞電壓門控性鈉通道的抑制作用是多種成分共同作用的結果還是某單一成分的效應尚有待進一步的研究。參考文獻：1黃敬耀，周瑾，魏海，等.復方二精靈抗老年性癡呆的藥理實驗研究J.江西醫學院學報，200

18、1，41(2)：5356.2黃芳，陳桃林，蒙義文.黃精多糖對老齡大鼠記憶獲得和記憶再現的影響J.應用與環境生物學報，1999，5(1):3939.3錢彥叢，宇文萍.枸杞子的化學成分及藥理研究新進展J.中醫藥學報，20004：3335.4artinezS,StriggF,ShrderUH,etal.Na+anda2+hestasispathays,elldeathandprtetinafterxygen-gluse-deprivatininrgantypihippapalslieulturesJ.Neursiene2022,1284：729740.5HeittKE,StysPK,LesiukHJ

19、.Theuse-dependentsdiuhannelblkerexiletineisneurprtetiveagainstglbalisheiinjuryJ.BrainRes2001，8982：281287.6SangN,engZ.BlkadebyagnesiufsdiuurrentsinautelyislatedhippapalA1neurnsfrat.JBrainRes2002，9522：218221.7IkedaT,ishiaK,AN,etal.binatintreatentfnenatalratsithhypxia-isheiaandendtxinindueslng-lastingeryandlearningipairentthatisassiatedithextendederebraldaageJ.AJbstetGynel2022，1916：21322141.8NEighGN,GlasperER,KflerJ,etal.ardiaarrestithardipulnaryresusitatinreduesdendritispinedensityinA1pyraidalellsandseletivelyaltersaquisitinfspatialeryJ.EurJNeursi2022，20