1、上海市第六人民醫(yī)院院級課題研究基金 上海市第六人民醫(yī)院基金申請書 項目名稱 控制性促排卵過程中的血清代謝組學與性激素相關(guān)性分析依托科室 生殖醫(yī)學中心 申 請 人 王利紅 職 稱 副主任醫(yī)師 起止年限 2016年3月-2017年6月 申報日期：2016年1月10日上海市第六人民醫(yī)院院級課題研究基金 一、申請人信息姓 名王利紅性 別女出生日期1976.3.3最高學歷博士研究生最高學位博士畢業(yè)院校山東大學科 室生殖醫(yī)學中心職 稱副主任醫(yī)師研究領(lǐng)域生殖內(nèi)分泌與代謝辦公電話24056306移動電子郵件二、項目摘要（限400字）摘 要控制性促排卵技術(shù)的使用大大推動了IVF-ET技

2、術(shù)的快速普及，除B超與性激素檢測外，COS的效果仍缺乏有效評價手段，建立一種新型高效的COS促排效果的早期評價技術(shù)具有十分重要的臨床意義。代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學后又一新興的生物學研究技術(shù)，通過比較樣本間代謝物水平的變化，可篩選出與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物標志物。目前，該方法已應用于診斷的疾病、藥效的判斷以及疾病轉(zhuǎn)歸，但在生殖技術(shù)領(lǐng)域中的研究僅局限于實驗室與男科方面，女性不孕研究發(fā)展緩慢，而與ART控制性促排卵技術(shù)相關(guān)的研究處于空白。本課題選取IVF控制性促排卵周期中獲得的血清，利用GC-MS與LC-MS技術(shù)及有關(guān)生物信息學的方法，研究在竇卵泡發(fā)育過程中，控制性促排卵過程中四個關(guān)鍵

3、點（啟動日、Gn56天、HCG日、取卵日）的血清代謝物種類及濃度變化，進一步分這些代謝產(chǎn)物與性激素變化的相關(guān)性。為臨床輔助生殖技術(shù)中的促排卵方案的改進提供一些創(chuàng)新性的客觀指標提供理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞（用分號分開，最多5個）控制性促排卵，代謝組學，性激素經(jīng)費申請表支 出 科 目金 額(元)計 算 根 據(jù) 及 理 由設(shè)備費無（如果填寫，則需要說明理由）材料費無（如果填寫，則需要說明理由）測試化驗加工費3.6萬元轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心檢測費300元/樣，共計120個樣本，合計3.6萬元出版/文獻/信息傳播/知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)費無（如果填寫，則需要說明理由）差旅費無（如果填寫，則需要說明理由）其他無（如果填寫，則需要說明

4、理由）合 計3.6萬元 報告正文立項依據(jù)與研究內(nèi)容項目立項依據(jù)進入二十一世紀，不孕癥已經(jīng)成影響人類身心健康的重大疾病之一，10%的發(fā)病率讓成年上萬的家庭長期保守無法生育的困擾。控制性促排卵技術(shù)（controlled ovarian stimulation，COS）的使用大大推動了IVF-ET技術(shù)的快速普及，顯著提高了ART助孕患者的成功率。然而目前，判斷COS的促排效果通常采用性激素與B超監(jiān)測卵泡大小，前者主觀性太強，性激素分泌易受多種因素的干擾，有時不能準確反映卵子發(fā)育情況，如拮抗劑的使用,反應卵泡生長的雌激素水平通常與獲卵數(shù)更相關(guān),而與卵子的質(zhì)量沒有相關(guān)性1。因此，臨床上我們?nèi)匀狈δ軌蛴行?/p>

5、預測COS技術(shù)對卵子發(fā)育影響的監(jiān)測指標，也就無法早期預測COS中發(fā)生的不可逆的卵子損傷，從而失去改善的機會。因此，建立一種新型高效的COS促排效果的早期評價技術(shù)，對于改善COS中的卵子質(zhì)量，提高IVF的促排卵效果具有十分重要的意義。代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學后又一新興的生物學研究技術(shù)。有Nicholson于1999年最早提出2，該技術(shù)以組群特征分析為基礎(chǔ)，以分子量1000Da小分子代謝物（包括各種氨基酸、部分多肽、脂肪酸、核苷酸等）為研究對象，以高通量分離、檢測和處理數(shù)據(jù)為手段，通過比較樣本間代謝物水平的變化，鑒定生物體在不同生理狀態(tài)下的特征代謝物，篩選出與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物標

6、志物。該方法具有效率高、靈敏度高和特異性高的特點，目前已開始應用于診斷的疾病、藥效的判斷以及疾病轉(zhuǎn)歸，在探索疾病的發(fā)生機理，在疾病診斷領(lǐng)域有著廣闊的應用前景。自代謝組學的方法應用于生殖醫(yī)學領(lǐng)域以來，在卵泡液代謝組學、胚胎代謝組學、精漿代謝組學等領(lǐng)域發(fā)展迅速，2007年2015年的相關(guān)研究文獻詳見表一。匯總分析后，發(fā)現(xiàn)代謝組學在生殖醫(yī)學領(lǐng)域中的應用仍處于起步階段，研究僅局限于實驗室與男科方面，女性不孕癥的血清代謝組學研究報道很少，僅見對多囊卵巢綜合征，子宮內(nèi)膜異位癥的血清代謝標志物的研究表一：第四部分，而在ART控制性促排卵技術(shù)相關(guān)的研究處于空白。在少數(shù)不孕及相關(guān)疾病的血清代謝組學的研究當中，有

7、關(guān)PCOS的分析顯示多為脂質(zhì)代謝途徑、糖代謝途徑上的中間或終末代謝產(chǎn)物分泌異常，如2015年楊兆鵬等3采用基于反向的液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（RPLC/Q-TOF-MS）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對74例PCOS患者進行了脂質(zhì)組學的分析，定性鑒別出15類314中的脂質(zhì)化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者與正常人相比，不飽和脂肪酸、部分鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯呈上調(diào)趨勢; 部分磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰膽堿、溶血性磷脂酰乙醇胺呈下調(diào)趨勢。而肥胖多囊卵巢綜合征患者與非肥胖多囊卵巢綜合征患者相比，不飽和脂肪酸、鞘磷脂、甘油二酯、甘油三酯上調(diào)更為明顯; 溶血性磷脂酰膽堿、部分磷脂酰膽堿下調(diào)

8、更為明顯。2015年，喬杰等4在 HYPERLINK /pubmed/26057937 o Free radical biology & medicine. Free Radic Biol Med新發(fā)表的有關(guān)PCOS卵泡液代謝組學的研究，結(jié)果表明：無肥胖的高雄激素血證中間代謝產(chǎn)物變化，卵丘細胞中的氧化還原電位失平衡導致線粒體功能障礙，卵泡液中間代謝產(chǎn)物提供了卵丘細胞線粒體與PCOS卵巢局部代謝特征的聯(lián)系。代謝組學在子宮內(nèi)膜異位癥疾病診斷中的應用價值近年來受到關(guān)注。2015年 Vincente等用5NMR技術(shù)檢測了45例的患者晨尿中的代謝產(chǎn)物，相比對照組，發(fā)現(xiàn)更低濃度的肌酐，牛磺酸，纈氨酸，賴氨

9、酸等，而這些因子大多數(shù)是參與炎癥與氧化應激過程的物質(zhì)。2015年 Jana等6應用NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥患者的血清當中，與糖代謝增加一致的是，檸檬酸和琥珀酸在EMT的患者中增加。高水平的氧化應激產(chǎn)物，脂質(zhì)過氧化反應以及氧化蛋白產(chǎn)物，降低了患者的抗氧化能力，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，谷胱甘肽也同時降低。增加的糖代謝以及線粒體呼吸系統(tǒng)缺陷提供了過多的活性氧，可能是導致EMT產(chǎn)生的主要原因。Cordeiro等7從腹腔鏡確診的子宮內(nèi)膜異位癥的IVF患者卵泡液中進行脂質(zhì)代謝組學的研究后發(fā)現(xiàn)，無EMT組中存在著磷脂酰甘油磷酸膽堿，磷脂酰絲氨酸，phosphatidylnositol二磷酸的分泌。

10、在子宮內(nèi)異癥組，鞘磷脂和磷脂酰膽堿更豐富。據(jù)我們查詢的文獻，國內(nèi)外均未見有關(guān)體外受精-胚胎移植技術(shù)常用COS技術(shù)中血清代謝組學的研究。促排卵過程中，性激素的改變反應了機體的應答效應，其相關(guān)代謝產(chǎn)物必然發(fā)生不同程度的變化，這些代謝產(chǎn)物的變化是否存在可探尋的規(guī)律，可否反應卵子的質(zhì)量，對客觀評價COS技術(shù)具有重要的臨床應用價值，亟待研究。本課題選取IVF控制性促排卵周期中獲得的血清，利用GC-MS與LC-MS技術(shù)及有關(guān)生物信息學的方法，研究在竇卵泡發(fā)育過程中，控制性促排卵過程中四個關(guān)鍵點（啟動日、Gn56天、HCG日、取卵日）的血清代謝物種類及濃度變化，進一步分這些代謝產(chǎn)物與性激素變化的相關(guān)性，為臨

11、床輔助生殖技術(shù)中的促排卵方案的改進提供一些創(chuàng)新性的客觀評價指標。參考文獻：1、梁曉燕，馬文紅，楊剛。控制性卵巢刺激中HCG注射后雌二醇濃度下降的原因分析。中山大學學報(醫(yī)學科學版)，2010，31（4）:530-532.2、 HYPERLINK /kcms/detail/search.aspx?dbcode=CJFQ&sfield=au&skey=%e5%88%98%e8%b4%a4%e9%9d%92&code=31071622;07630868; t _blank 劉賢青， HYPERLINK /kcms/detail/search.aspx?dbcode=CJFQ&sfield=au&sk

12、ey=%e7%bd%97%e6%9d%b0&code=31071622;07630868; t _blank 羅杰。植物代謝組學技術(shù)研究進展。科技導報，2015，33 (16): 33-38.3、楊兆鵬,徐芳,趙欣捷,等。基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的多囊卵巢綜合征患者血清脂質(zhì)組學分析。分析化學，2015，43（10）：1445-1451.4、Zhao H, Zhao Y, Li T, Qiao J,et a. Metabolism alteration in follicular niche: The nexus among intermediary metabolism, mitochond

13、rial function, and classic polycystic ovary syndrome. HYPERLINK /pubmed/26057937 o Free radical biology & medicine. Free Radic Biol Med. 2015,86:295-307. .5、Vicente-Muoz S(1), Morcillo I(2), Puchades-Carrasco L Nuclear magnetic resonance metabolomic profiling of urine provides a noninvasive alternat

14、ive to the identification of biomarkers associated with endometriosis.Fertil Steril. 2015，Epub ahead of print6、 HYPERLINK javascript:void(0); Jana SK , HYPERLINK javascript:void(0); Dutta M , HYPERLINK javascript:void(0); Joshi M , HYPERLINK javascript:void(0); Srivastava S , HYPERLINK javascript:vo

15、id(0); Chakravarty B , HYPERLINK javascript:void(0); Chaudhury K . 1H NMR based targeted metabolite profiling for understanding the complex relationship connecting oxidative stress with endometriosis. HYPERLINK /search?q=BioMed%20research%20international%5bjournal%5d o BioMed research international

16、Biomed Res Int 2013; 329058. 7、Cordeiro FB(1), Cataldi TR(1), Perkel KJ(2), Lipidomics analysis of follicular fluid by ESI-MS reveals potential biomarkers for ovarian endometriosis.J Assist Reprod Genet. 2015 Oct 26. Epub ahead of print項目的研究內(nèi)容、研究目標，以及擬解決的關(guān)鍵科學問題研究目的：本研究擬從代謝組學的角度出發(fā)，以人體外受精促排卵周期為實驗模型，研究

17、機體在促排卵過程中代謝狀況的變化，以及與性激素九項的相關(guān)性，尋找卵泡發(fā)育過程中評價COS效果的新的代謝標記物，旨在探討影響機體促排中的代謝途徑，闡明促卵過程引起卵子損傷的機理，為今后有針對性地采取措施避免卵子損傷提供理論基礎(chǔ)。具體包括：1、利用GC-MS/LC-MS技術(shù)，建立COS四個關(guān)鍵時間點上的血清代謝物圖譜，對差異代謝物進行生物信息學分析，初步篩選COS中的促進卵泡生長發(fā)育的標志性代謝物。2、觀察IVF促排過程中幾個關(guān)鍵時間點的血清代謝物變化與性激素變化的關(guān)系，為進一步多角度優(yōu)化促排卵過程以獲得更優(yōu)質(zhì)卵子提供一個新的思路。擬采用的研究方案及可行性分析研究方案：1、一般資料：IVF促排卵周

18、期選擇2016年82017年1月因單純輸卵管因素或男性因素在六院生殖中心行IVF/ICSI治療的女性，共30例，年齡在2538歲，BMI位于1924kg/m2，OGTT、甲功3項正常。采用拮抗劑案促排卵。排除標準：PCOS，EMT患者。2、血液樣品的采集與處理血液樣品：選擇啟動日、促排56日、HCG扳機日、取卵日的四個點，分別用促凝劑采血管從患者靜脈采集血液5ml，靜置30min后離心（4000rpm離心10min，湘儀離心機廠，）分離血清，移入1.5ml的EP管中，-80度保存，待測。3、血液性激素指標檢測和數(shù)據(jù)分析卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌激素（E2）、孕激素（P）、垂體泌乳素（PRL）、睪酮（T）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）、游離睪酮（FT）、絨毛膜促性腺激素（HCG）等指標（全自動熒光生化分析儀，美國ACCESS 2）（表一）。4、液相色譜/氣譜聯(lián)用質(zhì)譜（LC-MS/GC-MS）分析技術(shù)樣本分析前使血清在室溫解凍