1、山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫構(gòu)建和分析論文摘要：為了研究山葡萄不同成熟期過程中的關(guān)鍵基因，以轉(zhuǎn)色期50%著色山葡萄果皮為材料，提取總RNA合成cDNA，連接到質(zhì)粒載體pDNR-LIB上，采用電穿孔法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5中，成功構(gòu)建了山葡萄果皮cDNA文庫。文庫質(zhì)量鑒定說明，原始文庫滴度為1.12x10 pfu-mL ，擴增后的文庫滴度為2.82x10 pfu-mL ，重組率接近100%，插入片段大小范圍在0.52kb之間，平均約為0.8kb，說明應(yīng)用SMART 技術(shù)已成功構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫。論文關(guān)鍵詞：山葡萄,文庫,轉(zhuǎn)色期山葡萄V.amurensisRupr亦稱東北葡萄，分布

2、于我國東北、華北以及俄羅斯遠東地區(qū)和朝鮮半島，是我國重要的野生果樹資源。山葡萄對嚴寒具有極強的抗性，并且漿果果香濃郁，風(fēng)味獨特，因而成為我國東北釀造葡萄酒的主要原料。山葡萄作為葡萄屬中最抗寒的一個種，是典型的非躍變型果實，其生長動態(tài)表現(xiàn)為雙S;曲線特點。根據(jù)果實在不同時期的生長特點和生長快慢，將漿果的生長發(fā)育分為三個階段：第、期為快速生長期，第期為緩慢生長期，處于第期末和第期開始之間的時期稱作轉(zhuǎn)色期Veraison。轉(zhuǎn)色期是葡萄學(xué)家描述漿果成熟生長和顏色改變的開始，它是一個形態(tài)大小、硬度、色澤和內(nèi)部生理生化呈現(xiàn)劇烈變化的時期，其表現(xiàn)為生長加速，漿果開始軟化并伴隨著可溶性糖含量的增加和有機酸含量

3、的下降；表皮葉綠素發(fā)生降解并逐漸消失，紅色品種的花色素開始積累，與香氣、味道有關(guān)的次生化合物也開始生成。cDNA文庫是目前發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的根本工具，反映的是來源細胞當(dāng)時基因組表達出的基因序列信息。因而可以從cDNA文庫中篩選到目的基因，并直接用于該基因的表達。cDNA文庫在研究特定類型細胞基因組的表達狀態(tài)以及表達基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢。從cDNA文庫中隨機挑取克隆，從5或3端測序獲得150500bp的短序列稱為表達序列標簽ExpressedSequenceTags,ESTs。將獲得的EST序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比擬，獲得對基因組結(jié)構(gòu)、表達等認識的基因組研究策略被稱為植物表

4、達序列標簽EST方案。EST反映的是基因的編碼局部，所以EST方案可以直接獲得基因表達的信息。本文采用Clontech公司的cDNA文庫構(gòu)建試劑盒以pDNR-LIB為載體，構(gòu)建了山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮的cDNA文庫。從而提供了在分子生物學(xué)角度上研究山葡萄果實品質(zhì)形成、產(chǎn)量形成及采收期的選擇提供了理論的依據(jù)，為在分子水平上更深層次的研究相關(guān)成分的生物合成機理、抗病的分子機制及相關(guān)基因的克隆，篩選積累根底材料。1材料與方法1.1材料1.2試劑CreatorSMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒購自Clontech公司；感受態(tài)細胞EscherichiacoliElectro-cellsDH5和DNAmarker

5、DL2000均購自TaKaRa生物技術(shù)公司；RQ1RNase-FreeDNase購自Promega公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.3總RNA的提取山葡萄果皮總RNA提取采用改進的CTAB法，對提取出的總RNA進行純化。具體步驟如下：將沉淀后的RNA用40lDEPC水溶解，分別參加5l10 xReactionBuffer，5lDnase8:1:1，混合均勻，稍離心，37消化30min；加DEPC水至總體積300l，再加300l氯仿抽提一次，取上清參加3倍體積的無水乙醇，1/10體積的3mol-L的NaAc，-20沉淀30min；于4下以13000r-min離心30min，棄上清，沉淀用

6、75%乙醇洗滌23次，真空或自然枯燥，再用DEPC水溶解，置于-70下保存?zhèn)溆谩Ｒ?.1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA的純度和是否降解，用紫外分光光度計測定含量。1.4cDNA文庫的構(gòu)建文庫具體操作步驟參照CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit說明書進行。取1L總RNA約1g用于合成cDNA第一鏈，取2L單鏈cDNA做模板進行長距離PCRLD-PCR。反響參數(shù)為：95中預(yù)變性1min；95變性15s，68延伸6min，共24個循環(huán)；至4時結(jié)束反響。引物為：SMARTIVOligonucleotide：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGC

7、CATTACGGCCGGG-3；CDS/3PCRPrimer：5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)NN-3；5PCRPrimer：5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3。取5LPCR產(chǎn)物在1.1%瓊脂糖凝膠電泳觀察雙鏈cDNA的分子量分布情況。取50L雙鏈cDNA，用蛋白酶K消化，再以SfiI酶切，然后用CHROMASPIN-400Column過柱分級別離并回收純化。將回收的雙鏈cDNA與經(jīng)SfiI酶切的去磷酸化的pDNR-LIB載體分別按1:2、1:1、1:1.5體積比連接表1，16過夜。反響結(jié)束后，通過電穿孔將含有cDNA的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到感受

8、態(tài)細胞DH5中。將轉(zhuǎn)化細胞用LB液體培養(yǎng)基補足1mL，37振蕩培養(yǎng)1h。取50L稀釋物涂布于37預(yù)熱的90mm含30gL氯霉素的LB平板上，37過夜培養(yǎng)。次日檢查平板菌落生長狀況，將到達要求的連接轉(zhuǎn)化混合物會聚到一起獲得未擴增的原始文庫。表1cDNA與載體連接反響的體系Table1ComponentsofreactionofligationcDNAintovectorL cDNA 0.1g-L pDNR-LIB 10 x 連接緩沖液* 10 mmol-L ATP T4 DNA連接酶 去離子水 連接反響A 0.5 1.0 0.5 0.5 0.5 2.0 連接反響B(tài) 1.0 1.0 0.5 0.5

9、 0.5 1.5 連接反響C 1.5 1.0 0.5 0.5 0.5 1.0 *連接緩沖液組分：500mol-LTris-HCl(pH7.8)、100mol-LMgCl、100mol-LDTT、0.5mg-mL牛血清白蛋白1.5文庫質(zhì)量鑒定隨機挑取16個單菌落，使用M13引物進行菌液PCR鑒定。反響參數(shù)為：9430s；9430s，682min，進行25個循環(huán)反響；726min。反響結(jié)束后，取5LPCR產(chǎn)物進行1.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，確定文庫重組率和插入片段大小。原始文庫不穩(wěn)定，可按照試劑盒上的說明書測定原始文庫的滴度，文庫的滴度以每毫升含噬菌斑形成單位plagueformingu

10、nit，pfu的數(shù)目計算。根據(jù)滴度在LB瓊脂板上擴增文庫，文庫擴增后加25%的甘油置于-80下保存。1.6EST序列和功能分析本實驗對1009個隨機挑取的單菌落進行3端測序。測序引物為T7。測序由北京華大基因公司完成。用Phred程序讀取測序峰圖文件，將獲得的測序結(jié)果用Cross-Match軟件結(jié)合手動操作去除載體序列及低質(zhì)量序列。處理后的序列向GenBank的dbEST提交，用phrap程序?qū)ST進行contig拼接，從而獲得較完整的一致性ESTs序列。對于得到的非冗長ESTs序列，使用BlastX將其和GenBank提供所提供的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫Non-redundantdatabase,

11、NR進行同源性比擬，從而獲得局部ESTs功能確實定和提示，然后依據(jù)NCBI提供的蛋白直系同源數(shù)據(jù)庫Clustersoforthologousgroupsofproteins,COGs的標準對他們進行分類。2實驗結(jié)果2.1總RNA的提取提取山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮總RNA，經(jīng)核酸測定儀測定其紫外吸收值，OD為1.94，說明獲得的RNA純度較高，經(jīng)1.1%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖1顯示，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，亮度比接近21，RNA沒有降解，比擬完整，其純度和完整性均符合建立cDNA文庫的要求。圖1總RNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1agarosegelelectrophoresisoftot

12、alRNA2.2dscDNA的合成反轉(zhuǎn)錄后第一鏈cDNA經(jīng)過LD-PCR合成dscDNA。經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，dscDNA片段的長度大多集中500bp以上圖2。進一步說明RNA質(zhì)量合格，降解量少，dscDNA的長片段較多，已經(jīng)符合建庫要求。圖2山葡萄dscDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜1：雙鏈cDNA；M：DL2000分子量1:dscDNA;M:DL2000Marker2.3山葡萄的cDNA分級別離dscDNA經(jīng)過蛋白酶K消化和SfiI酶切后，再經(jīng)過CHROMASPIN-400柱分級別離。收集片段大小不同等級的cDNA片段，共收集16個離心管，每管一滴。別離結(jié)束后，每管取3L進行1.1%

13、瓊脂糖凝膠電泳，電泳10min左右。電泳結(jié)果圖3說明，16管幾乎沒有cDNA片段；從第7管開始出現(xiàn)cDNA彌散片段，并且cDNA的片段逐漸變?。?10管中的cDNA長片段多，長度分布范圍根本大于500bp；從11管以后開始有明顯小于500bp的片段，舍去11管以后的cDNA片段，防止過多的小片段與載體優(yōu)先連接。因此合并710管的cDNA用于連接。圖3山葡萄dscDNA過柱分級別離電泳圖譜1-16:過柱后的dscDNA；M:DL2000分子量1-16:dscDNAseparatedbyCHROMASPIN-400;M:DL2000Marker2.4cDNA文庫質(zhì)量鑒定初始文庫可間接反響文庫的大小

14、，文庫的大小以庫容量來表示。庫容量是衡量文庫代表性的量化指標之一，它反映的是該文庫能包含多少來源細胞中表達的信息，以當(dāng)時來源細胞中mRNA種類的重組cDNA分子數(shù)來表示。經(jīng)檢測，在3個cDNA與pDNR-LIB載體連接反響中，連接反響C效果最好，cDNA與載體比例為1.5:1。山葡萄果皮轉(zhuǎn)色期初始文庫滴度為1.12x10pfu-mL。對原始文庫進行擴增，擴增后的文庫滴度為2.82x10pfu-mL。隨機挑取16個單菌落，進行菌落PCR擴增鑒定，估計文庫的重組率和插入片段大小。電泳結(jié)果圖4顯示，插入片段范圍在0.52kb，平均長度約0.80kb，沒有空載體，重組率接近100%，說明所構(gòu)建的cDN

15、A文庫質(zhì)量較高。圖4山葡萄cDNA文庫插入片段的PCR檢測1-16:cDNA插入片段；M:DL2000分子量1-16:cDNAinsertfragment;M:DL2000Marker2.5EST序列分析及功能分析山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫測序獲得1009條EST序列，其中無空載體序列，有35條插入片段小于100bp的低質(zhì)量序列，占總測序克隆數(shù)的3.47%。去除低質(zhì)量的序列后，最終獲得了974條高質(zhì)量的ESTs序列，占全部測序量的96.53%。對其進行GenBank提交，GenBank接受號碼為：GW666520GW667493，這974條ESTs有效序列長度跨度從100bp595bp，平均

16、長度為403.15bp。利用phrap軟件進行序列拼接，共獲得710個unigenes。其中包括97個重疊群Contigs，613個單拷貝ESTSinglets，非冗余序列占全部序列的72.90%。經(jīng)過BlastX分析，所有ESTs中未知功能蛋白和比對后沒有顯著匹配序列分別占33.47%和25.87%。通過單一EST序列與NCBI的BlastP比對，并進行COGs分類表2，基因序列總數(shù)共163個，其中屬于代謝基因序列62個，占基因總數(shù)38.04%；屬于信息儲存和加工基因序列40個，占基因總數(shù)24.54%；屬于細胞加工基因序列37個，占基因總數(shù)22.70%；屬于未知不明確基因序列24個，占基因總

17、數(shù)14.72%。表2山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫ESTs的COG分類結(jié)果Fig2COGclassificationofveraisonpericarpfromV.amurensis 分類 功能注釋 數(shù)目/個 百分率(%) 信息儲存和加工 翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物發(fā)生 36 22.09 轉(zhuǎn)錄 3 1.84 RNA加工和修飾 1 0.61 細胞加工 轉(zhuǎn)譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊 26 15.95 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 5 3.07 細胞內(nèi)交換、分泌和液泡轉(zhuǎn)運 3 1.84 細胞壁/膜/膜外的發(fā)生 2 1.23 細胞能動性 1 0.61 代謝 能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換 19 11.66 碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝 13 7.98 脂

18、質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝 10 6.13 輔酶轉(zhuǎn)運和代謝 7 4.29 氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝 7 4.29 次生代謝生物合成、轉(zhuǎn)運和分解代謝 3 1.84 無機離子轉(zhuǎn)運和代謝 2 1.23 核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝 1 0.61 未知不明確 僅有功能提示 22 13.5 功能未知 2 1.23 3討論制備高質(zhì)量的RNA是構(gòu)建一個成功cDNA文庫的重要前提。在山葡萄果皮總RNA提取過程中，要時刻注意RNA酶的污染。由于山葡萄果實中富含多糖、多酚等次生代謝產(chǎn)物，而且多糖類物質(zhì)與RNA具有相似的結(jié)構(gòu)，因為在提取過程中會與RNA形成膠狀物而共沉淀，降低RNA產(chǎn)量和純度。果實中的多酚物質(zhì)在提取過程中易發(fā)生氧化，形成醌類，從而與

19、RNA形成不可逆結(jié)合，導(dǎo)致RNA活性喪失并在后續(xù)酚仿抽提過程中喪失。本實驗采用的改進CTAB法針對試材多糖、多酚含量高的特性，參加低濃度的乙醇和高濃度的醋酸鉀有效去除了多糖。CTAB提取液中參加了-巰基乙醇，-巰基乙醇既可以用來抑制RNA酶的活性，還可以作為強復(fù)原劑防止多酚氧化，打斷多酚氧化酶的二硫鍵使之失活，從而成功提取出純度和完整性均符合要求的山葡萄果皮總RNA。文庫的完整性和覆蓋度是構(gòu)建cDNA文庫的關(guān)鍵，但同時還需注意組織的特異性和文庫內(nèi)基因的代表性。本文采用Clontech公司的CreatorSMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒和SMART技術(shù)構(gòu)建山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫。在提取高質(zhì)

20、量的總RNA的前提下，不經(jīng)過mRNA的純化過程，防止了別離純化mRNA會喪失片段的情況，直接用總RNA建庫，mRNA最大限度地轉(zhuǎn)化為cDNA，從而有效地保證cDNA的完整性。采用SMART技術(shù)建庫，不需要甲基化、接頭平端等煩瑣操作。LD-PCR合成cDNA第二鏈時，PCR擴增循環(huán)數(shù)確實定對于cDNA文庫質(zhì)量有很大影響，循環(huán)數(shù)太少那么產(chǎn)量低，循環(huán)數(shù)過多可能會增加短片段高拷貝基因的比率，因為PCR擴增時短片段cDNA會優(yōu)先擴增。根據(jù)所用總RNA的質(zhì)量，本研究用24個循環(huán)LD-PCR合成第二鏈cDNA，從PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果來看，效果理想。cDNA文庫構(gòu)建過程中的分級別離操作非常重要，要去除局部小于5

21、00bp的cDNA片段，防止插入片段的平均長度過短，否那么文庫的應(yīng)用價值降低。但過多的篩除cDNA片段，勢必造成原始文庫的滴度降低，影響文庫的質(zhì)量。本文合并了710管的cDNA樣品，收到良好的效果。文庫的滴度、重組率及插入片段的大小是鑒定cDNA文庫質(zhì)量的指標。一般文庫的滴度能到達10pfu-mL以上為有效的文庫。本文所獲得的山葡萄果皮轉(zhuǎn)色期cDNA文庫的原始滴度為1.12x10pfu-mL，擴增后的文庫滴度為2.82x10pfu-mL，插入片段平均長度為0.80kb，沒有空載體，重組率接近100%。這些數(shù)據(jù)都說明此文庫能夠滿足構(gòu)建完整文庫和下一步實驗的要求。cDNA文庫作為研究生物體功能基因

22、組的主要手段,在基因篩選、別離和克隆中具有重要作用。在對山葡萄轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫ESTs的分析中，我們發(fā)現(xiàn)了Ser-Thr激酶類，即絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該激酶是一大類特異地催化蛋白質(zhì)絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的激酶家族，參與多種信號傳導(dǎo)過程，是一種胞內(nèi)蛋白質(zhì)，具有抗病信號傳導(dǎo)途徑。文庫中還包括了大量的RPR蛋白，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、鋅脂蛋白、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白等，同時發(fā)現(xiàn)了多個與花色苷代謝相關(guān)的基因，包括4-香豆酰CoA連接酶、查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶、類黃酮3,5-羥化酶、花青素3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等。通過對這些基因進行克隆和序列分析，從而對掌握葡萄果實抗脅迫防御機制和調(diào)控

23、花色苷的生物合成具有重要的意義。cDNA文庫只代表一定時期一定條件下正在表達的基因，是整個真核基因組中的少局部序列，所以構(gòu)建特定時期表達的cDNA文庫只能收錄山葡萄果實在某一成熟期時表達的基因信息。這對于徹底了解山葡萄成熟過程中不同時期基因表達的規(guī)律，掌握相關(guān)功能基因的調(diào)控機理是遠遠不夠的。只有構(gòu)建不同成熟期，不同組織部位特異性的cDNA文庫，同時結(jié)合表達序列標簽，基因芯片等現(xiàn)代分子生物技術(shù)，才能開掘抗病，抗蟲，高產(chǎn)等優(yōu)質(zhì)基因，最終為山葡萄品種的改進做出奉獻。山葡萄果皮轉(zhuǎn)色期cDNA文庫隨后測序工作的完成，將為山葡萄重要功能基因的克隆鑒定和山葡萄基因組的研究奠定根底。參考文獻1 LIU Chu

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