1、第七章 微生物的生長與環(huán)境條件 通過本章的學習，要求掌握：1、微生物生長的研究方法；2、細菌純培養(yǎng)生長曲線各個時期的主要特點；3、物理因子，化學藥物對微生物生長的影響；4、微生物生長的控制。 重點：細菌純培養(yǎng)生長曲線，微生物生長的控制。 難點： 如何利用細菌純培養(yǎng)生長曲線的對數(shù)生長期來計算細菌的代時和代數(shù)。 第一節(jié) 微生物生長的研究方法生長: 微生物在適宜的環(huán)境條件下，不斷地吸收營養(yǎng)物質，并按照自己的代謝方式進行代謝活動，如果同化作用大于異化作用，則細胞質的量不斷增加，體積得以加大，于是表現(xiàn)為生長。簡單地說，生長growth就是有機體的細胞組分與結構在量方面的增加。繁殖: 單細胞微生物如細菌，

2、生長往往伴隨著細胞數(shù)目的增加。當細胞增長到一定程度時，就以二分分裂方式形成兩個基本相同的子細胞。這種由于細胞分裂而引起的個體數(shù)目的增加，稱為繁殖reproduction。在多細胞微生物中，如某些霉菌，細胞數(shù)目的增加（菌絲細胞的不斷延長或分裂）如不伴隨著個體數(shù)目的增加，只能叫生長。只有通過形成無性孢子或有性孢子使得個體數(shù)目增加的過程才叫做繁殖。發(fā)育:在一般情況下，當環(huán)境條件適合，生長與繁殖始終是交替進行的。從生長到繁殖是一個由量變到質變的過程，這個過程就是發(fā)育development。如果某一或某些環(huán)境條件發(fā)生改變，并超出了生物可以適應的范圍時，就會對機體產生抑制乃至殺滅作用。一、純培養(yǎng)技術 微生

3、物在自然界總是混雜地生活在一起，要想研究某一種微生物，必須把研究對象從混雜群體中分離出來。微生物學中將在實驗室條件下由一個細胞或一種細胞群繁殖的后代稱為純培養(yǎng)pure culture。獲得純培養(yǎng)的方法: 1、稀釋平板法pour plate method 2、劃線分離法streak plate method 平行劃線 扇形劃線 連續(xù)劃線利用選擇培養(yǎng)基分離微生物： 根據(jù)所要分離的菌種的特性選用培養(yǎng)基，如：分離真菌用馬丁氏培養(yǎng)基，pH偏酸；分離放線菌用高氏1號培養(yǎng)基，pH中性偏堿。不同微生物對化學試劑的敏感性不同：從土壤中分離細菌在培養(yǎng)基中加制霉菌素抑制真菌生長；從土壤中分離真菌時，在培養(yǎng)基中加孟加

4、拉紅和鏈霉素抑制細菌生長。根據(jù)分離對象的營養(yǎng)特征分離特殊微生物：分離纖維素分解菌時，培養(yǎng)基以纖維素為唯一碳源。分離固氮菌，用無氮培養(yǎng)基，以N2作氮源。二、微生物生長量的測定 1測定總菌數(shù)（即總的細胞數(shù)量）： 計數(shù)板直接測數(shù) 染色涂片計數(shù)法 比濁法 2. 測定活菌數(shù)： （1）稀釋平板測數(shù)法 （2）稀釋培養(yǎng)測數(shù)法 （3）薄膜過濾計數(shù)法 3.測定細胞生物量： （1）測定細胞干重 （2）測定總氮量 （3）測定DNA含量 (4) 測定ATP含量 (5）測定代謝活性顯微計數(shù)法 染色涂片計數(shù)法 取0.01ml的菌懸液放在1cm2 的玻片上，讓其干燥，然后固定染色，再置顯微鏡下計數(shù)每一視野中的菌數(shù)，算出視野面

5、積，按下列公式即可求出每ml原菌液中的含菌數(shù)。 每ml菌液中的含菌數(shù)=視野中的平均菌數(shù)1cm2/視野面積100 比濁法 比濁法的原理是利用細菌細胞在溶液中數(shù)量越多，濁度越大，在光電比色計中測定時所吸收的光線越多（即透過的光線少） 方法是先要測定出一條標準曲線，即將菌液制成不同濁度的稀釋液，將此不同濁度的稀釋液用光電比色計測出其消光值，再把這各種濁度的稀釋液用顯微鏡直接計數(shù)法測出其中的含菌數(shù)，以不同濁度的稀釋液的消光值作縱坐標，以不同濁度稀釋液所含的菌數(shù)作橫坐標，繪出標準曲線。有了標準曲線，就可以取未知菌液測消光值后通過查此曲線得知未知菌液中的含菌數(shù)。此方法在工業(yè)發(fā)酵中應用較多，因為它快速，節(jié)約

6、時間。測定微生物的活菌數(shù)viable count 稀釋平板測數(shù)法dilute plate count以CFU(colony forming units)表示 稀釋培養(yǎng)測數(shù)法（又稱最大概率法，MPN most probable number）例如：某細菌在稀釋培養(yǎng)法中生長情況如下：稀釋度: 103 104 105 106 107 108重復數(shù): 5 5 5 5 5 5有菌生長管數(shù)： 5 5 5 4 1 0 根據(jù)上述結果，數(shù)量指標為“541”，查表得近似值為17，乘以第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，得出原始培養(yǎng)物的活菌數(shù)=17105個 薄膜過濾計數(shù)法； 此法用于計數(shù)空氣中的含菌數(shù) 當一定體積的空氣通過濾膜后，

7、將濾膜培養(yǎng)后計數(shù)濾膜上的菌落數(shù)即可求出單位體積空氣中的含菌數(shù)。細胞生物量測定1.細胞干重測定：單位體積的培養(yǎng)液中的微生物細胞的干重。（如菌絲干重g/100ml）2.總氮量測定法：用化學分析方法測出微生物細胞中蛋白質或氮元素的含量。 蛋白質的含量=氮量6.253.DNA含量測定法：用熒光法測定微生物細胞中DNA含量。 細菌平均每個含DNA的量為8.4105 ng，若測得某樣品中的DNA含量為8.410-2ng，則測定樣品中含有1000個細菌 4.ATP含量測定法: 以分光光度法測定它的熒光素熒光素酶反應的強度,經換算即可求得生物量。5.代謝活性法：根據(jù)微生物生命活動的強度來估算生物量。如單位體積

8、培養(yǎng)物在單位時間內的O2消耗、糖消耗或產酸產CO2量等，它們在一定程度上間接地反映細胞生物量。三、細菌的純培養(yǎng)生長曲線 以少量純培養(yǎng)細菌接種一定容積的培養(yǎng)基中經過培養(yǎng)生長，最后一次收獲，此稱分批培養(yǎng)(batch culture)。利用分批培養(yǎng)可以測定細菌純培養(yǎng)生長曲線。細菌純培養(yǎng)生長曲線: 將少量細菌的純培養(yǎng)體接種到新鮮的液體培養(yǎng)基中，定期測定菌體數(shù)量，開始時生長緩慢，然后細菌數(shù)目以對數(shù)增加，繼而穩(wěn)定在最高生長量上，最后逐漸降低，進入衰老死亡階段，如用座標法作圖，以時間為橫座標，以菌數(shù)的對數(shù)增長量為縱座標，可以繪出一條曲線，我們將此曲線叫做細菌純培養(yǎng)生長曲線。細菌純培養(yǎng)生長曲線衰亡期穩(wěn)定期對數(shù)

9、期滯留期細菌純培養(yǎng)生長曲線的分期及各期特點:延滯期 lag phase （滯留適應期） 菌種初接入新鮮培養(yǎng)液內，微生物細胞需要通過自身生理機能的調節(jié)逐步適應新環(huán)境。表現(xiàn)為細胞數(shù)量不增加但細胞個體體積增大，代謝活躍。對數(shù)期 logarithmic growth phase 細菌在這個時期生長旺盛，代謝活力強。分裂速度快，菌數(shù)以指數(shù)級數(shù)增加，代時穩(wěn)定。細胞在形態(tài)、生理等方面較為一致，是研究微生物生理代謝和遺傳變異的好材料。在工業(yè)生產中，也用對數(shù)期細胞作為擴大培養(yǎng)的種子液。利用對數(shù)生長期測定細菌的代時和代數(shù): 在對數(shù)生長期內，細菌數(shù)目的增加是按指數(shù)級數(shù)增加的 即 20 2 1 22 23 2n 這里

10、的指數(shù) n 為細菌分裂的次數(shù)或者增殖的代數(shù)，也就是一個細菌繁殖n代產生2n 個細菌。 如果在對數(shù)期 開始時間 t1的菌數(shù)為 x1 ， 繁殖 n 代后到對數(shù)期 后期t2的菌數(shù)為 x2， 則代時（Generation time，G）（即每增加一代所需要的時間）應為： G=（t2 - t1）/n 先求代數(shù)n 由于x2 = x1 2n lgx2 = lgx1 + nlg2 ； n=（lgx2 - lgx1）/lg2 n = 3.3 lg (x2 /x1 ) 即G =（t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1) 例如：在一細菌培養(yǎng)液中第一次測得的細菌數(shù)為 104 /ml，經過培養(yǎng) 4 h后，又測

11、得菌液中的細菌數(shù)為 108 /ml，求此菌的世代時間和在此時間內繁殖的代數(shù)。 根據(jù)公式： G = （t2 - t1 ）/3.3 lg (x2 /x1) t2 - t1 = （4 - 0） 60 min = 240 min x2 = 108 x1 = 104 lg(x2 /x1 ) = lg108 lg104 = 8 - 4 = 4 代入上式 G = 240/3.3 4 = 240/13.2 = 18 min 即在上述培養(yǎng)液中，世代時間為 18 min。 細菌繁殖代數(shù) n = (t2 - t1)/G = 240/18 = 13.3 代。穩(wěn)定期(stationary phase) 又稱恒定期或最高

12、生長期。處于穩(wěn)定期的微生物，新增殖的細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，整個培養(yǎng)物中二者處于動態(tài)平衡，此時生長速度，又逐漸趨向零。 在一定容積的培養(yǎng)基中，細菌為什么不能按對數(shù)期的高速率無限生長呢? 這是由于對數(shù)期細菌活躍生長引起周圍環(huán)境條件條件發(fā)生了一系列變化，某些營養(yǎng)物質消耗，有害代謝產物的積累，以及諸如pH、氧化還原電位、溫度等的改變，限制了菌體細胞繼續(xù)以高速度進行生長和分裂。 穩(wěn)定期的細胞內開始積累貯藏物，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數(shù)芽孢細菌也在此階段形成芽孢。如果為了獲得大量菌體，就應在此階段收獲，因這時細胞總數(shù)量最高； 這一時期也是發(fā)酵過程積累代謝產物的重要階段，某些放線菌抗生素的

13、大量形成也在此時期。 從上可以看出，穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上的達到了最高水平，產物的積累也達到了高峰，此時，菌體的總產量與所消耗的營養(yǎng)物質之間存在著一定關系，這種關系，生產上稱為產量常數(shù)。衰亡期(decline phase) 細菌死亡率逐漸增加，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了“負生長”。其中有一段時間，活菌數(shù)換幾何級數(shù)下降，故有人稱之為“對數(shù)死亡階段”。 這一階段的細胞，有的開始自溶，產生或釋放出一些產物，如氨基酸、轉化酶、外肽酶或抗生素等。菌體細胞也呈現(xiàn)多種形態(tài)，有時產生畸形，細胞大小懸殊，有的細胞內多液泡，革蘭氏染色反應的陽性菌變成陰性反應等。 四、二次生長：當培養(yǎng)液中同時存在兩種均能被微

14、生物利用的主要營養(yǎng)物時，微生物將首先利用其中較易利用的營養(yǎng)物開始生長。當較易利用的營養(yǎng)物被消耗完，進入穩(wěn)定期后，微生物經過短暫的適應，開始利用第二種營養(yǎng)物，再次開始新的對數(shù)生長，并進入新的穩(wěn)定期，表現(xiàn)為二階式的雙峰生長曲線，稱為二次生長曲線。五、連續(xù)生長（連續(xù)培養(yǎng)）當微生物在一個固定的容器中生長時，由于養(yǎng)料的消耗，代謝產物的積累，必然會導致微生物生長速度減慢，為了保持微生物能長時期的處于對數(shù)生長期，就要采用連續(xù)培養(yǎng)continuous culture，即在一個恒定容積的流動系統(tǒng)中，一方面以一定的速度不斷地加入新的培養(yǎng)基，另一方面又以相同的速度流出培養(yǎng)物，這樣就可以使容器中微生物的數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)

15、保持恒定，使微生物長期處于旺盛生長階段。 連續(xù)培養(yǎng)的原理是利用細菌在生長曲線中的對數(shù)期生長最快。 恒化連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 恒濁連續(xù)培養(yǎng) 恒濁連續(xù)培養(yǎng)： 不斷調節(jié)流速而使細菌培養(yǎng)物濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)叫恒濁連續(xù)培養(yǎng)。 由光電裝置檢測培養(yǎng)容器中的濁度，根據(jù)濁度變化控制新鮮培養(yǎng)液流入和舊培養(yǎng)流出速度，使容器內菌液濃度恒定。 工業(yè)發(fā)酵中用此法可獲得大量菌體及代謝產物。 恒化連續(xù)培養(yǎng)： 控制恒定流速，使由于細菌生長而耗去的營養(yǎng)物及時得到補充，又叫恒組成連續(xù)培養(yǎng)。這樣，細菌的生長速率將取決于限制性因子的濃度。 恒化連續(xù)培養(yǎng)多用于微生物學的研究工作中。從遺傳學角度來講，它允許我們作長時間的細菌培養(yǎng)而能從中

16、分離不出的變種；從生理學方面看，能幫助我們觀察細菌在不同生活條件下的變化，尤其是DNA、RNA及蛋白質合成的變化；同時它也是研究自然條件下微生物生態(tài)體系比較理想的實驗模型，因為，生長在自然界的微生物一般都處于低營養(yǎng)濃度條件下，生長也較慢。而恒定連續(xù)培養(yǎng)正好可通過調節(jié)控制系統(tǒng)來維持培養(yǎng)基成分的低營養(yǎng)養(yǎng)濃度，使之與自然條件相類似。六、同步培養(yǎng)在分批培養(yǎng)中，各個細胞的生理狀態(tài)、代謝活動并不完全一樣。如果以群體測定結果的平均值來代表單個細胞的生長或生理特性是不符合客觀實際的，然而利用單個細胞進行研究又是很困難的。為了解決這一問題，就必須設法使群體處于同一發(fā)育階段，使群體和個體行為變得一致，因而發(fā)展了單

17、細胞的同步培養(yǎng)技術。 同步培養(yǎng)法：能使培養(yǎng)的微生物處于比較一致的生長發(fā)育階段上的培養(yǎng)方法叫同步培養(yǎng)法synchronous culture。 過濾分離法 1、機械法 區(qū)帶離心法 膜洗脫法 溫度調整法2、誘導法 營養(yǎng)調整法 芽胞萌發(fā)法 3、 解除抑制法：采用碟呤等代謝抑制劑阻斷細 胞DNA的合成，然后大量稀釋解除抑 制，使細胞同步生長。 機械法對細胞正常生理代謝影響很少；而誘導同步分裂雖然方法多，應用較廣，但對正常代謝有時有影響，而且對其誘導同步化的生化基礎了解很少，化學誘導同步化的本質還是一個尚待研究的問題。 同步生長的時間，因菌種和條件而變化，由于同步群體的個體差異，同步生長不能無限地維持，

18、往往會逐漸破壞，最多能維持23個世代，又逐漸轉變?yōu)殡S機生長，即非同步化。第二節(jié) 真菌的生長 一、絲狀真菌在固體培養(yǎng)基上的生長繁殖 絲狀真菌菌絲生長與營養(yǎng)有關。營養(yǎng)豐富，分支多而密，營養(yǎng)貧乏，分支少而稀。 菌絲的生長是頂端生長，菌絲各個部分都有極性之分，即位于前端的為幼齡菌絲，位于后面的為老齡菌絲。菌絲生長與營養(yǎng)有關，營養(yǎng)豐富則分支點與菌絲生長頂端的距離短，即分支多而頻繁；營養(yǎng)貧乏分支點同菌絲生長頂端距離長，即分支少。菌絲在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時形成菌落。二、絲狀真菌在液體培養(yǎng)基中的生長絲狀真菌在液體培養(yǎng)基中的生長可分為三個生長階段即: 延緩期 迅速生長期 衰退期三、孢子生長 真菌無性孢子的形成可分為

19、五個階段： 1、分生孢子梗形成 2、核移動到分生孢子梗內 3、分生孢子梗膨脹 4、頂端出芽，并形成一串互相連通的芽 5、芽與芽之間產生橫隔，將它們分隔成成串孢子無性孢子繁殖過程： 孢子腫脹（外源腫脹，不需營養(yǎng)； 內源腫脹，需要營養(yǎng)） 萌發(fā)管形成 菌絲生長 包括 真菌有性孢子形成是由于性激素產生，研究較多的幾種性激素是： 1、三孢酸 2、誘雄激素 3、成精激素和成卵激素 綿霉的有性孢子形成過程分為以下幾個步驟1、首先由雌性菌體分泌一種類固醇性質的成精激素（antheridiol），它可以連續(xù)不斷地產生，并擴散到基質中；2、雄性菌體在接受成精激素后，會發(fā)生多方面反應，促進其本身產生雄器或精子，同時

20、，它可以反過來合成另一種激素稱為成卵激素（oogoniol hormone）；3、雌性菌體在接受成卵激素以前，沒有任何形態(tài)變化，直到接受了成卵激素后，才促進形成藏卵器，并大量產生成精激素，以吸引雄器或精子；4、吸引和識別的結果使藏卵器與雄器結合，進行有性生殖。真菌的二型現(xiàn)象有些真菌，尤其是絲狀真菌如毛霉和假絲酵母，在不同環(huán)境下，可以從菌絲型變?yōu)閱渭毎鲅拷湍感停蛘呦喾矗山湍感娃D變?yōu)榫z型，這種生長型的轉變稱為二形現(xiàn)象。二型轉變受環(huán)境因子的控制。第三節(jié) 環(huán)境條件對微生物生長的影響 生長是微生物與外界環(huán)境因素共同作用的結果。環(huán)境條件的改變，在一定限度內，可能引起： A. 微生物形態(tài)，生理、生長

21、、繁殖等特征的改變， B. 微生物抵抗、適應了環(huán)境條件的某些改變； C. 導致微生物的死亡。幾個基本概念 防腐antisepsis 它是一種抑菌作用。利用某些理化因子，使物體內外的微生物暫時處于不生長繁殖但又未死亡的狀態(tài)。這是一種防止食品腐敗和其他物質霉變的技術措施。如低溫、干燥、鹽腌、糖漬等等。 消毒disinfection 是指殺死或消除所有病原微生物的措施，可達到防止傳染病傳播的目的。例如將物體煮沸10 min，就可殺死病原菌的營養(yǎng)體，但不能殺死細菌的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物體表面的消毒。 滅菌sterilization 是指用物理或化學因子，殺滅物體中的所有生活微生物，包括最耐

22、熱的細菌芽孢。這是一種徹底的殺菌措施。通過滅菌的物品不再存在任何有生命的有機體。 化學治療chemotherapy 是指利用某些具有選擇毒性的化學藥物(如磺胺)或抗生素，對生物體的深部感染進行治療，可以有效地消除宿主體內的病原體，但對宿主卻沒有或基本上沒有損害。一、溫度對微生物生長的影響微生物生長的溫度類型低溫型微生物psychrophiles 又稱嗜冷微生物，可分為專性嗜冷和兼性嗜冷兩種。 它們或者分布在地球兩極地區(qū)的水域和土壤中，這里大部分地區(qū)幾乎終年冰凍，即使在其微小的液態(tài)水間隙中也有微生物的存在；它們或者分布在平均溫度為5左右的海洋中;或者分布在只有12的海洋深處；還有的分布于冷泉。

23、冷藏食物的腐敗往往由這類微生物引起。嗜冷微生物嗜冷機理： 1、細胞內的酶在低溫下酶活性高； 2、細胞膜中不飽和脂肪酸含量較高，細胞膜在低溫下仍保持半流動狀態(tài)，從而能進行活躍的物質代謝。中溫型微生物mesophiles 它們又可分為室溫性微生物和體溫性微生物。室溫性微生物適于2030生長，如土壤微生物、植物病原微生物。體溫性微生物多為人及溫血動物的病原菌，它們生長的極限范圍在1045，最適生長溫度與其宿主體溫相近，在2540之間，人體寄生菌為37左右。中溫型微生物不能在低溫條件下生長是由于： 1、中溫型微生物在低溫下蛋白質的合成過程不能啟動； 2、低溫下，受代謝產物的反饋抑制。 高溫型微生物th

24、emophiles 它們適于在4550以上的溫度中生長，在自然界中的分布僅局限制于某些地區(qū)，比如堆肥在發(fā)酵過程中溫度常高達6070。能在5570中生長的微生物有Bacillus、Methanobacterium等。分布于溫泉中的細菌，有的可在近于100的高溫中生長。這些耐高溫的微生物，經常給罐頭工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)帶來麻煩。 微生物的耐熱性一般而言： 原核生物大于真核生物 非光合微生物大于光合微生物 簡單生物大于復雜生物 高溫微生物耐高溫的主要原因： 1、具耐熱的酶和蛋白質及其合成系統(tǒng) 2、細胞膜富含飽和脂肪酸，利于膜在高溫下保持穩(wěn)定 不同微生物的致死溫度不同： 多數(shù)細菌、酵母菌、霉菌的營養(yǎng)細胞和病

25、毒，在5065條件下12 min可致死； 放線菌和霉菌孢子比營養(yǎng)細胞的抗熱性強，7680條件下10 min才被殺死； 細菌芽孢抗熱性最強，100以下處理相當長時間才能致死。例如肉毒梭菌的芽孢沸水中5.0-9.5小時才被殺死。 同一菌種不同菌株或不同菌齡，其抗熱性也可能不同 一般幼齡的比老齡的對熱敏感。例如菌齡為1.75 h和2.75 h的大腸桿菌在53加熱15 min，其菌數(shù)分別下降10，000倍和2， 000倍，而菌齡為62 h，在同樣條件下菌數(shù)只下降12倍。 同一種微生物在生長發(fā)育的不同階段，對溫度的要求不一樣: 例如：灰色鏈霉菌的菌體最適生長溫度為37，而產生鏈霉素的最適生長溫度為28。

26、 又如：青霉素產生菌菌體的最適生長溫度為30，而產生青霉素的最適溫度為23。 又如：黑曲霉菌體生長的最適生長溫度為37，而產酶的溫度為28。 又如：人工栽培的食用菌菌絲生長的最適溫度為25左右，而子實體分化的溫度通常大都在18左右。 培養(yǎng)基的成分對微生物的抗熱性也有影響。例如在富含蛋白質的培養(yǎng)基上生長的細菌，可能由于在菌體周圍形成了一層蛋白質膜而提高了抗熱能力。 溫度在生產實踐中的應用:高溫殺菌 干熱滅菌 焚燒滅菌法 此法滅菌徹底，迅速簡便，但使用范圍有限。常用于接種工具、污染物品以及實驗動物尸體等廢棄物的處理。 干熱滅菌法 主要在干燥箱中利用熱空氣進行滅菌。通常160170處理2 h便可達到

27、滅菌的目的。此法只適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品的滅菌。其優(yōu)點是可保持物品干燥。 濕熱滅菌 煮沸消毒法 物品在水中煮沸15 min以上，可殺死細菌的所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢。這種方法適用于注射器、解剖用具等的消毒。 高壓蒸汽滅菌法 是實驗室及生產中常用的滅菌方法。加壓則可提供高于100的蒸汽。加之蒸汽熱穿透力強，可迅速引起蛋白質凝固變性。所以高壓蒸汽滅菌在濕熱滅菌法中效果最佳、應用較廣。一般培養(yǎng)基、各種緩沖溶液、玻璃器皿等常采用此方法滅菌，其工藝條件為: 0.1Mpa /cm2 (121) 處理30 min手提式滅菌鍋的使用方法：1、加水2、裝鍋3、加熱和排除冷空氣4、升壓保壓、計時5、降壓

28、排汽6、出鍋滅菌鍋冷空氣排除程度與鍋內溫度的關系 間歇滅菌法 常壓下100處理1530 min，以殺死其中的營養(yǎng)細胞。冷卻后，置于一定溫度(2837)保溫過夜，使其中可能殘存的芽孢萌發(fā)營養(yǎng)細胞，再以同樣方法加熱處理。如此反復三次，可殺滅所有芽孢和營養(yǎng)細胞，以達到滅菌的目的。 此法的缺點是滅菌比較費時，在缺乏高壓蒸汽滅菌設備時可用此方法滅菌。巴斯德消毒法 用較低的高溫處理牛奶、酒類等飲料，以殺死其中的病原菌如結核桿菌、傷寒桿菌等，但又不損害營養(yǎng)與風味。巴氏消毒法的工藝條件為： 6263/30 min或71 /15 min 這種方法只能殺死大多數(shù)腐生菌的營養(yǎng)體而對芽孢無損害。此法是基于結核桿菌致死

29、溫度為62/15 min而規(guī)定的。微生物的致死溫度 在一定時間內（如 10 min）殺死微生物所需要的最低溫度稱為微生物的致死溫度。 微生物的致死時間 在一定溫度下殺死微生物所需要的最短時間稱為微生物的致死時間。溫度愈高，致死時間愈短。 D 值 decimus value 在特定溫度下使微生物菌數(shù)減少 10 倍所需的時間。 二、 pH 值對微生物生長的影響 微生物在 pH49 之間都可以生長。 細菌、藻類、原生動物最適 pH 為6.57.5 放線菌最適 pH 7.58.0 霉菌、酵母最適 pH 56pH 值影響微生物生長的主要作用在于： 引起細胞膜電荷的變化，從而影響了微生物對營養(yǎng)物質的吸收；

30、 影響代謝過程中酶的活性； 改變營養(yǎng)物質的可給性以及有害物質的毒性。微生物生長繁殖的最適pH與其合成某種代謝產物的pH通常是不一樣的。 例如丙酮丁醇梭菌生長繁殖最適 pH 是 5.57.0，丙酮丁醇梭菌合成丙酮丁醇的最適 pH 是 4.35.3。 微生物在不同的 pH 下積累的代謝產物不一樣。 黑曲霉在 pH 23 的環(huán)境中發(fā)酵蔗糖以產檸檬酸為主，產草酸極少；而在 pH 近中性時發(fā)酵蔗糖產生大量的草酸，檸檬酸產量很低。 可利用微生物對pH要求的不同，控制雜菌的污染。 無機酸如硫酸、鹽酸等殺菌力雖強，但腐蝕性大,很少應用；某些有機酸如苯甲酸可用作防腐劑；酸菜、飼料青貯則是利用乳酸菌發(fā)酵產生的乳酸

31、抑制腐敗性微生物的生長。 強堿可用作殺菌劑，但由于其毒性大，用途有局限性。如生石灰用于對排泄物及倉庫、棚舍等環(huán)境的消毒。強堿對G+與病毒比對G-作用強。結核分枝桿菌抗堿力特強。三、氧與氧化還原電位根據(jù)氧與微生物生長的關系，可將微生物分成五類： 專性好氧微生物Strict aerobes 專性厭氧微生物Strict anaerobes 兼性好氧微生物facultative aerobes 微需氧微生物microaerophilic bacteria 耐氧微生物aerotolerant anaerobes 五類微生物的比較 微生物 超氧化物歧化酶 過氧化氫酶 過氧化物酶專性好氧微生物 + + -專

32、性厭氧微生物 - - -兼性好氧微生物 + + -微需氧微生物 + + -耐氧微生物 + - +氧化還原電位（Eh值）與微生物生長的關系 影響Eh的因素很多，分子態(tài)氧的影響尤為重要。其次是培養(yǎng)基中氧化還原物質的影響。不同的微生物對氧化還原電位的要求不一樣。 好氣微生物要求Eh值在 +0.1 伏以上，以 0.3至 0.4 伏為宜。 兼性好氧微生物Eh值在 0.1 伏以上行呼吸作用，在 0.1 伏以下行發(fā)酵作用。 厭氣性微生物 Eh 值在 0.1 伏以下為宜。 向培養(yǎng)基中通入空氣或加入氧化劑可提高基質中的 Eh 值，以培養(yǎng)好氣微生物。在培養(yǎng)基中加入還原性物質如半胱氨酸、亞硫酸鈉、Na2S 等可降低

33、基質中的氧化還原電位，以培養(yǎng)厭氣性微生物。 輻射是指通過空氣或外層空間以波動方式從一個地方傳播或傳遞到另一地方的能源。它們或是離子或是電磁波。電磁輻射包括可見光、紅外線、紫外線、X射線和射線等可見光 只有光能營養(yǎng)型的微生物才需要400800 nm可見光進行光合作用。有的微生物對光有趨光性，如閃光須霉。擔子菌形成子實體也需要散射光的照射。 微生物細胞經照射后，在有氧情況下，產生光化學氧化反應，生成H2O2，能發(fā)生強烈氧化作用，引起細胞死亡。四、 輻射 紫外線 紫外線對微生物有殺傷作用，UV 的波長在 136400 nm 之間，以波長為265266 nm 的殺菌力最強。在醫(yī)療衛(wèi)生和無菌操作中廣泛應

34、用。紫外線穿透能力差，只適用于空氣及物體表面消毒。 紫外輻射的殺菌機制復雜，最明顯的是形成胸腺嘧啶二聚體。 UV照射引起的微生物損傷在有光時可在 DNA 修復酶的作用下進行修復，此稱為光復合作用，所以微生物經 UV 照射后應放在黑暗處，特別是在誘變育種中。 電離輻射 X射線與射線、射線和射線均為電離輻射。它們的波長很短（X 射線0.0613.6 nm； 射線 0.010.14 nm）有足夠的能量從分子中逐出電子而使之電離。 電離輻射的殺菌作用通過射線引起細胞中水分子在吸收能量后導致電離所產生的自由基起作用。 射線是由某些放射性同位素如60Co發(fā)射出的高能輻射，具較強的穿透力，能致死所有的生物。

35、現(xiàn)已制出了用于不耐熱的大體積物品消毒的射線裝置。干燥會導致細胞失水而造成代謝停止以至死亡。不同微生物種類，干燥時微生物所處的環(huán)境條件，干燥的程度均影響干燥對微生物的效果。結核分枝桿菌特別耐干燥，在此環(huán)境中，100 20 min仍能生存；鏈球菌用干燥法保存幾年而不喪失致病性。休眠孢子抗干燥能力也很強，在干燥條件下可長期不死，這一特性已用于菌種保藏。生產或科研中常用真空干燥法來保藏細菌、病毒及立克次氏體。在日常生活中常用烘干、曬干和熏干等方法來保存食物。五、 干燥六、滲透壓若置微生物于高滲溶液(如20%NaCl)中，水將通過細胞膜從細胞內進入細胞周圍的溶液中，造成細胞脫水，使細胞不能生長甚至死亡。

36、相反，若將微生物置于低滲溶液(如0.01%NaCl)或水中，外環(huán)境中的水將從溶液進入細胞內引起細胞膨脹，甚至使細胞破裂。由于一般微生物不能耐受高滲透壓，所以日常生活中常用的高濃度的鹽或糖保存食物，如腌漬蔬菜、肉類及蜜餞等。糖的濃度通常為5070%，鹽的濃度為1015%。七、超聲波超聲波(頻率在20000 Hz以上)具有強烈的生物學作用。超聲波的作用是使細胞破裂，幾乎所有的微生物都能受其破壞，其效果與頻率、處理時間、微生物種類、細胞大小、形狀及數(shù)量等均有關系。 淋病奈氏球菌對超聲波極為敏感，而發(fā)光細胞卻要處理1.5 h才死亡。病毒的抗性較強。一般來說，高頻率比低頻率殺菌效果好，球菌較桿菌抗性強。細菌芽孢具更強的抗性，大多數(shù)情況下不受超聲波影響。 科研中常用此法破碎細胞。八、化學藥物 重金屬鹽 重金屬離子帶正電荷，易與帶負電荷的菌體蛋白質結合，使蛋白質變性，有較強的殺菌作用。 升汞（HgCl2 ）：0.050.1% 用于非金屬器皿的消毒 。 紅汞：2% 水溶液用于皮膚，