1、第2章 體外分析技術(shù)概 述20世紀(jì)60年代,Berson和yalow,放射免疫分析(RIA),諾貝爾獎(jiǎng).20世紀(jì)70年代,Engvall和Wecman,酶標(biāo)記免疫分析(EIA)80年代時(shí)間分辨熒光免役分析(TRFIA)化學(xué)發(fā)光免役分析(CLIA)電化學(xué)發(fā)光免役分析(ECLIA)微粒體發(fā)光免役分析(MLEIA)放射免疫分析一、原理 Ag+Ab AgAb+Ag + *Ag *Ag+*AgAb 二、試劑盒 （一）抗體(結(jié)合劑）：高親和力、高特異性、高滴度 （二）標(biāo)記抗原 125I,放化純，長(zhǎng)半衰期，標(biāo)記后不改變抗原活性。 （三）標(biāo)準(zhǔn)品 與被測(cè)物為同一物質(zhì)，定量精確，放化純高 （四）B與F 分離技術(shù)

2、（五）放射性測(cè)量?jī)x實(shí)驗(yàn)操作步驟123456789Ag0ng/ml 0.1ml5ng/ml 0.1ml10ng/ml 0.1ml20ng/ml 0.1ml40ng/ml 0.1ml80ng/ml 0.1ml12345678Ag0ng/ml 0.1ml5ng/ml 0.1ml10ng/ml 0.1ml20ng/ml 0.1ml40ng/ml 0.1ml80ng/ml 0.1ml待測(cè)1 0.1ml待測(cè)2 0.1ml*Ag0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1mlAb0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml搖均勻后，放置待其

3、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)達(dá)平衡后分離試劑2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml2ml測(cè)總射線（可以測(cè)2-3管求均值）去除上清液測(cè)B；也可求出F畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測(cè)品的Ag含量1. 配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗 原Ag的反應(yīng)管，并標(biāo)明濃度；2.分別向反應(yīng)管中加入固定量的 *Ag、Ab；3.經(jīng)過一定時(shí)間的溫育競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 反應(yīng)；4.待競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)平衡后，分 離結(jié)合B（Bond）部分和游 離F(Free)部分；5.用放射性探測(cè)器測(cè)得*Ag-Ab 放射性為B或游離*Ag的放射 性為F；6.計(jì)算出結(jié)合率B%B/（B+F）100， 或B/B0%；B0為不含Ag的結(jié)合率，因Ag 為“0”，故B0 *Ag-Ab的

4、結(jié)合率為最大結(jié)合率；7.以B%或B/B0為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)抗原 濃度為橫坐標(biāo)，繪制出B%或B/B0 隨Ag量變化的曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。608.在相同條件下，測(cè)得被測(cè)樣品Ag的B%或樣品/B0%的濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可查出被測(cè)樣品Ag的濃度。 三、分離方法 （一）液相分離技術(shù) 1.雙抗體沉淀法 2.聚乙二醇法(PEG) 3.葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法 4.活性炭吸附法 （二）固相分離技術(shù)四、實(shí)驗(yàn)操作步驟 加樣、溫育、分離、測(cè)定 放射性、數(shù)據(jù)處理五、實(shí)驗(yàn)分析性能（穩(wěn)定性） （一）精密度 （二）靈敏度 （三）準(zhǔn)確度六、質(zhì)量控制 免疫放射分析法一、基本原理 1968年由Miles和Hales建立免役放

5、射分析法（IRMA）原理:125I標(biāo)記抗體做示蹤劑與非標(biāo)記抗原(待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)形成復(fù)合物,除去多余的游離抗體,測(cè)量復(fù)合物的放射性。特點(diǎn)： 1 屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抗原、抗體結(jié)合反應(yīng) 2 抗原-抗體復(fù)合物的量與所加非標(biāo)記抗 原的量呈正相關(guān) 3 在低劑量區(qū)不會(huì)有不確定因素 4 免疫放射分析法的非特異結(jié)合對(duì)低劑 量區(qū)結(jié)合影響大，對(duì)分離條件的要求 非常嚴(yán)格二、基本方法 （一）雙抗體夾心法 （二）標(biāo)記第三抗體法 （三）其他方法三、RIA與IRMA的比較 RIA IRMA標(biāo)記物 抗原 抗體原理 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 非競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合抗體量 限量 過量標(biāo)準(zhǔn)曲線 負(fù)相關(guān) 正相關(guān) 達(dá)到平衡的速度 慢 快 可測(cè)范圍 窄 寬 應(yīng)用對(duì)象 大分子、小分子 大分子非放射性標(biāo)記免疫技術(shù)一、酶標(biāo)記免疫分析技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）二、化學(xué)發(fā)光分析法 化學(xué)發(fā)應(yīng)釋放自由能，