1、關(guān)于植物總的提取與電泳第一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 實驗?zāi)康暮鸵笳莆誖NA制備以及常用鑒定方法的原理、操作步驟、注意事項和技術(shù)關(guān)鍵。第二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識由于RNA是基因表達過程中非常重要的生物分子，如mRNA,它攜帶了DNA的全部編碼信息。RNA的分離是研究基因功能的重要基礎(chǔ)之一，在分子生物學(xué)中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern blot、RT-PCR、構(gòu)建 cDNA文庫、Gene Chips以及體外翻譯等實驗。第三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月由于RNase極穩(wěn)定，所以，在操作RNA時，要格外仔

2、細(xì)，以防RNA被降解。在提取RNA之前，必須對所用器皿進行RNase滅活處理。如用180oC干烤8小時以上處理玻璃器皿，或用0.1的焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃器皿和其它用品。所用水以及相關(guān)的緩沖液也需要用0.1 DEPC水處理，但Tris-Cl緩沖液等不可以用DEPC處理。注意：DEPC有致癌之嫌 ，必須小心操作，防止接觸與吸入 ！第四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月植物細(xì)胞內(nèi)的RNA主要是 rRNA（占8085）、tRNA及小分子RNA（占1015）和 mRNA（占15）。rRNA含量最豐富，由25S、18S和5S幾類組成。mRNA種類繁多，分子量從數(shù)百至數(shù)千堿基不等

3、，但絕大多數(shù)mRNA在3端都有一個polyA尾巴，因此，可根據(jù)此特性用寡聚脫氧胸苷(OligodT)層析柱從總RNA中將 mRNA分離出來。一般情況下，提取的總RNA也可用于Northern blot試驗。第五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月提取植物RNA時，要注意的問題：1）一般用機械研磨的方法破碎植物 組織細(xì)胞；2）要加入蛋白質(zhì)變性劑，使核蛋白 與RNA分離并釋放出RNA；3）抑制內(nèi)源和外源RNase活性；4）將RNA與DNA、蛋白質(zhì)及其它細(xì) 胞成分分開。第七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月苯酚法：用SDS變性蛋白并抑制RN

4、ase活性，經(jīng)多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；胍鹽法：用異硫氰酸胍或鹽酸胍和-巰基乙醇變性蛋白，并抑制RNase的活性，經(jīng)酚氯仿抽提后再沉淀；氯化鋰沉淀法：因為鋰在在一定pH下能使RNA相對特異地沉淀，但容易使小分子RNA損失，而且殘留的鋰離子對mRNA有抑制作用。已有多種較為成熟的分離總RNA的方法，常用的有3種:第八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月本實驗采用QIAGEN試劑盒，其原理是依據(jù)胍鹽法。即在含有強的異硫氰酸胍變性劑的提取液中裂解植物組織粉末，在提取緩沖液中含有RNase抑制劑，抑制RNase活性，保證RNA的完整性。通過第一次離心柱

5、時細(xì)胞碎片被阻留在柱子上，溶液均質(zhì)化，包括RNA在內(nèi)的分子物質(zhì)通過離心柱。加入乙醇后，再過第二個離心柱，RN A就結(jié)合在柱子底部有硅膠的膜上，洗去其它雜質(zhì)，最后用無RNase的水溶出RNA。該柱子可結(jié)合100g大于200bp的RNA，所以應(yīng)控制起始材料的用量。第九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA的檢測：RNA的檢測主要用瓊脂糖凝膠電泳，分為非變性電泳和變性電泳。一般變性電泳用的最多是甲醛變性電泳（如Northern blot 實驗過程中）。第十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月由于RNA分子是單鏈核酸分子，它不同于DNA的雙鏈分子結(jié)構(gòu)，其自身可以回折形成發(fā)卡式二級結(jié)構(gòu)及

6、更復(fù)雜的分子狀態(tài)，以至通過一般傳統(tǒng)的瓊脂塘凝膠電泳難以得到依賴于分子量的電泳分離條帶，為此電泳上樣前將樣品于65攝氏度加熱變性5分鐘，使RNA分子的二級結(jié)構(gòu)充分打開，并且在瓊脂糖凝膠中加入適量的甲醛，可保證RNA分子在電泳過程中持續(xù)保持單鏈狀態(tài)，因此，總RAN樣品便在統(tǒng)一構(gòu)像下得到了瓊脂糖凝膠上的依賴于分子量的逐級分離條帶。第十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月而且RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜的結(jié)合。 RNA通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，可以直觀快捷的分析RNA質(zhì)量之優(yōu)劣，當(dāng)有標(biāo)準(zhǔn)的“分子標(biāo)尺”（marker）存在時，還可相對客觀的對總RNA樣品進行定性和定量。為測定片

7、段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物膠切下，上色、照像。第十二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 實驗材料與試劑材料： 新鮮植物組織 （水稻）試劑：Qiagen RNeasy植物試劑盒，甲醛，瓊脂糖電泳系統(tǒng) ，凝膠成象系統(tǒng)等。第十三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 實驗方法和步驟第十四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗步驟 （每一步均要求無RNase污染） 稱取新鮮材料100 mg，液氮速凍； 在預(yù)冷的研缽中并在液氮中將材料 研磨成細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移到2ml或1.5ml 離心管中； 待液氮揮發(fā)（但不

8、能解凍）后，加入 450 l提取緩沖液RLT，混勻后在 56下溫育13min；第十六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 將裂解液加到離心柱（淡紫色）上 下接一個2ml收集管，最大轉(zhuǎn)速離心 2min。裂解液通過柱子時被均質(zhì)化 小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一新離 心管；加入0.5倍體積（225 l）96100% 乙醇，混合均勻。加入乙醇后，可能 會出現(xiàn)沉淀，無影響；第十七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月將混合液全部（包括沉淀675 l） 轉(zhuǎn)移到吸附離心柱（粉紅色）內(nèi)， 下接2 ml的收集管，10000 rpm離心 15秒。棄去管內(nèi)液體；加入700l RW1緩沖液，10000rpm轉(zhuǎn)速

9、下離心25秒，棄去收集管；將離心柱轉(zhuǎn)移到一個新的2ml收集 管上，加入500l RPE緩沖液， 10000 rpm離心15秒，棄去管內(nèi)液體 重復(fù)使用收集管；第十八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月加入500l RPE到離心柱內(nèi)，最大轉(zhuǎn)速離心2min，干燥離心柱，棄去收集管；把離心柱接在一個新的1.5 ml Eppen管上，加入3050l 無RNase水（0.1%DEPC處理），10000 rpm離心 1min，洗出RNA。若RNA產(chǎn)量在20g以上，用3050 l無RNase水再洗脫1次。RNA樣品保存于-20備用。第十九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂糖凝膠非變性電泳所需

10、試劑：10凝膠緩沖液 嗎啉代丙磺酸（MOPS）（pH 7.0） 200mmol/L NaAC 50mmol/L EDTA （pH 8.0）10mmol/L 用DEPC水配制，用NaOH調(diào)節(jié)pH7.0。過濾除菌 后避光保存。10電泳上樣緩沖液 50（V/V）甘油（用DEPC處理的水稀釋） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 0.25（m/V）溴酚藍(lán) 0.25（m/V）二甲苯青FF第二十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠制備（1.2）：用1凝膠緩沖液配制1.2的凝膠，至少使其凝固30分鐘后進行上樣；樣品制備：在離心管中，將RNA樣品與10上樣緩沖液以9:1比例混勻，迅速在冰上冷浴

11、5分鐘，瞬時離心數(shù)秒。RNA上樣量為2-30g，本次實驗為10g；上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入加樣孔，以5V/cm的電壓電泳1h1.5h；待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長度的4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙錠溶液中染色約30min；在紫外燈下觀察結(jié)果(如果用于Northern blot ,在凝膠轉(zhuǎn)膜前應(yīng)做好移動距離的標(biāo)記)。步驟： 第二十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳步驟：制備凝膠(1.2)：稱1.2克瓊脂糖，加72ml DEPC處理的水，加熱溶化。冷卻至60oC，在通風(fēng)廚內(nèi)加入10凝膠緩沖液10ml， 甲醛（37）18ml， 混均后到入凝膠模具中。樣品制備：在離心管里，將RNA樣品與10樣品緩沖液以9：1比例混合。65oC溫浴510分鐘， 迅速在冰上冷浴5分鐘， 瞬時離心數(shù)秒。對于Northern雜交實驗，總RNA上樣量可達到10-30g。第二十二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月上樣