1、生化分析儀的參數(shù)設(shè)置 復(fù)制鏈接sinius1271#字體大小：t T口發(fā)表于2009-09-05 11:50 |只看樓主1.分析方法常見的分析方法有：終點(diǎn)分析法、連續(xù)監(jiān)測法、比濁測定法。1.1終點(diǎn)分析法1.1.1 一點(diǎn)終點(diǎn)法 該法 的特點(diǎn)是使用一種或兩種試劑，待測定物與試劑反應(yīng)達(dá)到終 點(diǎn)時(shí)，測定吸光度，計(jì)算待測物的濃度。該法常見的有總蛋 白雙縮脲法、白蛋白漠甲酚綠法、葡萄糖氧化酶法。1.1.2兩 點(diǎn)終點(diǎn)法也稱固定時(shí)間法。在單試劑分析中，該法可以組別處長（超級版主）生日 1976-9-17帖子4946積分57957性別男注冊時(shí)間2006-03-06相冊消除樣品以及試劑的顏色、濁度的干擾，其原理是

2、在樣品與 試劑混合后的延滯期后讀取一個(gè)點(diǎn)A1，一定時(shí)間后讀取A2, A=A2-A1，然后比較標(biāo)準(zhǔn)和測定的 A值，求得待測物的濃 度。單試劑分析常見的有肌酐苦味酸法。在雙試劑分析中， 該法還具有消除內(nèi)源性物質(zhì)測定的干擾，其原理是加入試劑1 后讀取A1，加入試劑2后讀取A2，A1相當(dāng)于讀出樣品空白值， A2才是實(shí)際呈色反應(yīng)，因此 A=A2-A1。1.2連續(xù)監(jiān)測 法其原理是在酶促反應(yīng)的最適條件下，用物理、化學(xué)或酶促反應(yīng)的分析方法，在反應(yīng)速度恒定期（零級反應(yīng)期）來 連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化，以單 位時(shí)間酶反應(yīng)初速度計(jì)算出酶活力的大小和代謝物的濃度。 其具體方法有兩點(diǎn)速率法和多點(diǎn)速

3、率法。1.2.1兩點(diǎn)速率 法觀察在零級反應(yīng)期內(nèi)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度，用兩個(gè)點(diǎn)的吸光度的差值（AA）除以時(shí)間（分），計(jì)算出每分鐘的吸 光度變化值。1.2.2多點(diǎn)速率法 在酶促反應(yīng)進(jìn)程的零 級反應(yīng)期內(nèi)每隔一定時(shí)間（2-30s）進(jìn)行一次監(jiān)測，連續(xù)監(jiān)測 多次，求出單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速度。1.3比濁測定法 自 動(dòng)化生化分析儀一般只能做透射比濁分析，其原理是在光源 的光路方向測量透過光強(qiáng)度，它常用于終點(diǎn)法測定，目前應(yīng) 用較多的為免疫透射比濁法。目前主要用于血清特種蛋白的 檢測，如載脂蛋白、微量蛋白、急性時(shí)相反應(yīng)蛋白、免疫球 蛋白以及某些藥物監(jiān)測等。2.溫度 一般生化分析儀的恒 溫控制器可以對25C、30C、3

4、7C三種溫度進(jìn)行恒溫，根據(jù) 需要可以任意選擇。由于酶在達(dá)到最適溫度以前，溫度每升 高10C，反應(yīng)速率增加1-2倍，因此IFCC推薦酶測定時(shí)的溫 度設(shè)置為37C。3.波長3.1單波長 當(dāng)測定體系中含有 一種組分或在混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質(zhì) 的吸收波長無重疊時(shí)，可選用。如果一個(gè)物質(zhì)有幾個(gè)吸收峰， 可選用吸光度最大的一個(gè)波長，或者選擇在吸收峰處吸光度 隨波長變化較少的某個(gè)波長。3.2雙波長 當(dāng)被檢溶液混濁或存在較多的干擾物質(zhì)時(shí)，測定時(shí)會(huì)出現(xiàn)光散射和非特 異性光吸收，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，此時(shí)可用雙波長 測定，以提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，而在實(shí)際應(yīng)用中選擇輔助 波長主要用于消除脂血、溶

5、血、黃疸的干擾。由于脂質(zhì)、血 紅蛋白、膽紅素在較寬的波長范圍內(nèi)有較強(qiáng)的光吸收，常常 同測定波長有重疊，此時(shí)測得的吸光度包含待測物質(zhì)的吸光 度和干擾物質(zhì)的吸光度，因此選用合適的輔助波長可以消除 干擾物質(zhì)的吸光度。輔助波長的設(shè)置原則是根據(jù)測定波長選 擇輔助波長，要求干擾物質(zhì)在測定波長同輔助波長有相同的 吸光度。4.樣品量和試劑量樣品和試劑量的設(shè)置原則一 般是根據(jù)試劑說明書上的比例，并結(jié)合儀器的特性進(jìn)行設(shè)置。 儀器的特性包括：樣品和試劑的最小加樣量及加量范圍、最 小反應(yīng)液的體積等。在實(shí)際工作中為節(jié)約成本可以根據(jù)比例 縮小樣品和試劑用量，但同時(shí)必須滿足最小反應(yīng)液總量。但 值得注意的是，樣品量不應(yīng)少于3

6、p 1，否則測試結(jié)果的重復(fù) 性差。5.稀釋水量 添加樣品稀釋水的目的是為了洗出粘 附在采樣針內(nèi)壁上的微量血清，減少加樣誤差，添加試劑稀 釋水的為了避免試劑間交叉污染，兩種稀釋水的量應(yīng)在復(fù)溶 試劑時(shí)按比例扣除。如用液體試劑盒時(shí)因不再加水，無法扣 除稀釋水量，所以兩種稀釋水的量應(yīng)盡量減少，以免試劑被 過量稀釋。6.孵育時(shí)間在終點(diǎn)分析法中，孵育時(shí)間的選擇應(yīng)充分考慮到干擾問題。在白蛋白漠甲酚綠法中，血清 中a 1-球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等亦可與漠甲酚綠呈色， 但其反應(yīng)速率較白蛋白為慢，而實(shí)際上，當(dāng)血清與白蛋白混 合時(shí)，“慢反應(yīng)”已經(jīng)發(fā)生，因此在漠甲酚綠與血清混合后 30s讀吸光度可明顯減少非特異性

7、結(jié)合反應(yīng)。在葡萄糖氧化酶 法中，葡萄糖氧化酶高特異性催化P -D-葡萄糖，而血清中葡 萄糖a和p構(gòu)型各占36%和 64%，要使葡萄糖完全反應(yīng)，必 須延長孵育時(shí)間使a -葡萄糖變旋為p構(gòu)型。此外，總膽固 醇、甘油三酯都采用酶法的Trinder反應(yīng)進(jìn)行測定，但該反 應(yīng)37C反應(yīng)較慢，必須測定這些酶試劑反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間， 自動(dòng)分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣后5min內(nèi)反應(yīng)完 全，所以應(yīng)該選擇分析儀的最大反應(yīng)時(shí)間。7.延遲時(shí) 間在酶促反應(yīng)一開始的階段，由于各種因素的影響，酶促反應(yīng)速率比較慢，可以是幾秒到幾分鐘，尤其是雙底物 反應(yīng)或需要輔酶參與者，通常為1-3min。而一般單試劑法只 需30s，常用

8、項(xiàng)目中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、 肌酸激酶需要特別注意。8.監(jiān)測時(shí)間酶促反應(yīng)延滯期后，在過量底物的存在下，反應(yīng)速率加快并達(dá)到一個(gè)反應(yīng)速 率穩(wěn)定的階段，即酶促反應(yīng)以恒定的速率進(jìn)行，不受底物濃 度的影響，這段時(shí)間稱為線性反應(yīng)期或零級反應(yīng)期，自動(dòng)化 生化分析儀的監(jiān)測時(shí)間即為此期。測酶的連續(xù)監(jiān)測法至少 90-120S或至少4點(diǎn)（3個(gè) A），少于3個(gè) A不能稱為連 續(xù)監(jiān)測法，因?yàn)椴荒苡?jì)算線性度。監(jiān)測時(shí)間過長則容易發(fā)生 底物耗盡，可測范圍變窄。9.試劑吸光度上限、下限 試 劑吸光度上限為正向反應(yīng)用，可參考試劑盒說明書數(shù)值折算 成所用比色杯的光徑。如試劑盒要求上限為0.4,比色杯光徑0.8cm，

9、則試劑吸光度上限設(shè)置為0.32。試劑吸光度下限為負(fù)向反應(yīng)用，設(shè)置法同試劑吸光度上限。超過限額表示試劑已變質(zhì)，應(yīng)更換合格試劑。10 .底物耗盡限額不同型號分析儀的設(shè)計(jì)不一樣，有的為零點(diǎn)與監(jiān)測第一點(diǎn)吸光度的 差額，有的為吸光度上升或下降至指定吸光度的數(shù)值。超過 限額說明樣品的酶活性非常高，底物消耗太快，在儀器程序 規(guī)定的線性反應(yīng)期內(nèi)吸光度的變化往往不代表真正的酶活 力，導(dǎo)致結(jié)果偏低，樣品應(yīng)稀釋5-10倍后重測。11.線性 度線性度是指“線性錯(cuò)誤”或“線性誤差”，其計(jì)算公式為：（A1-A2）/A3 X 100%，式中：A1為前2/3讀數(shù)時(shí)間的 斜率，A2為后2/3讀數(shù)時(shí)間的斜率，A3為總的斜率。線性

10、百 分?jǐn)?shù)大，說明 A之間已不成線性，超過限額說明底物不足， 檢測結(jié)果會(huì)變低，應(yīng)稀釋后重測。12.試劑空白速率試劑 空白速率為試劑在監(jiān)測過程中底物自動(dòng)降解得到的結(jié)果。其 值為以水代樣品測得的項(xiàng)目結(jié)果，樣本測定結(jié)果應(yīng)扣除試劑 空白速率。13 .線性范圍 按試劑的質(zhì)量而設(shè)置，超過范圍 應(yīng)增加樣品量或稀釋后重測。不同試劑公司的試劑質(zhì)量不一 樣，不同樣品試劑比的線性范圍也不一樣，應(yīng)實(shí)測試劑盒的 線性范圍。終點(diǎn)法可配制系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，按分析項(xiàng) 目的波長、樣品量、試劑量、孵育時(shí)間，測定各濃度的吸光 度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在線性內(nèi)的最高濃度為線性上限。14. 計(jì)算因子F值（或系數(shù)K） 14.1理論F值用連續(xù)

11、監(jiān)測法進(jìn)行酶活性測定時(shí)，不需作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)摩爾 消光系數(shù)很容易進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。先測定在線性范圍 內(nèi)每分鐘吸光度的變化（乙A/min），以U/L代表酶活性濃度 時(shí)，則可按下式進(jìn)行計(jì)算：U/L=A A/min=A A/minXVX106/（ XvX1）式中 V：反應(yīng)體 系體積（ml）； :摩爾吸光系數(shù)（cm2/mol）； v：樣品量（ml）； l：比色杯光徑（cm）； A：吸光度變化；106：將 mol換算成p mol。 因此當(dāng)條件固定時(shí)，從理論上講V、v 和l均為固定值，為常數(shù)，則上述公式可以簡化為U/L=A A/minXF，F(xiàn)=VX106/（ XvX1）。 系數(shù) F 值對酶 的

12、測定十分重要，過高雖然測定的線性較寬，但重復(fù)性差， 反之，雖然精密度好，但檢測線性窄，因此應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況 進(jìn)行合理的設(shè)置和應(yīng)用，F(xiàn)值的設(shè)置應(yīng)參考酶參考值的上限及 測定時(shí)間兩方面，以保證測定結(jié)果的可靠。14.2實(shí)際F 值在臨床實(shí)際工作中，儀器諸多因素如波長的準(zhǔn)確性、半波寬的大小、比色杯光徑及磨損與清潔度、溫控的準(zhǔn)確性、 加樣系統(tǒng)狀況等若不符合要求或發(fā)生變化都會(huì)影響指示物的 值或上述公式中的相關(guān)項(xiàng)。因此，應(yīng)在具體儀器條件下， 定期檢查和實(shí)際測定指示物的和系數(shù)F值（即儀器的實(shí)測F值)。 NAD (P) H的值因NAD (P) H不穩(wěn)定，可用葡 萄糖的己糖激酶法實(shí)測，其原理為：GLU + ATPHK

13、G-6-P + ADP ； G-6-P + NAD (P)+ G-6-PD 6-磷酸葡萄糖酸+ NAD(P)H + H+將某一濃度的葡萄糖溶液 (可設(shè)為10mmol/L)重復(fù)5-10次測定，得到相應(yīng)的吸光度， 求出Abar土s，s必須低于儀器規(guī)定的批內(nèi)允許值。根據(jù) =A bar/ (CXl)X V/v求出NAD (P) H的實(shí)際值，式中C 為標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mol/L) ； l為比色杯光徑(cm)； V為反應(yīng)總 體積(ml) ； v為樣品體積(ml)。再根據(jù)U/L=A A/min X F， 得到實(shí)際F值=CX106/A bar。此外，一些色素源指示物在不同的介質(zhì)環(huán)境中，其會(huì)發(fā)生程度不等的變化。對于對 硝基苯酚、對硝基苯胺和5-硫代-2-硝基苯甲酸等測這類可得 到高純而穩(wěn)定的指示物，