1、生物樣品的預(yù)處理2 生物樣品的預(yù)處理概述不同來源樣品分離的預(yù)處理細胞的破碎與分離沉淀技術(shù)2.1 概述 選材 提取（預(yù)處理） 分離純化濃縮、結(jié)晶、干燥 保存來源豐富，含量相對較高，雜質(zhì)盡可能少將目的物從材料中以溶解狀態(tài)釋放出來，方法與存在部位及狀態(tài)有關(guān)核心操作，須根據(jù)目的物的理化及生物學(xué)性質(zhì)及具體條件確定整個過程應(yīng)有快速靈敏準確的分析方法來衡量效果（回收率、純度）生化分離基本步驟選材的重要性之案例：青蒿素的提取毒理學(xué)和遺傳毒理學(xué)方法生物群落法生理生化方法監(jiān)測方法通過測定生物體內(nèi)污染物的含量，來估測環(huán)境污染程度。利用生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化及生態(tài)系統(tǒng)功能的變化為指標監(jiān)測環(huán)境污染。通過生物的行為，生

2、長、發(fā)育以及生理生化變化為指標來監(jiān)測環(huán)境污染狀況。一、生物監(jiān)測的主要方法有哪些？生物化學(xué)成份分析法以污染物引起機體病理狀態(tài)和死亡為指標監(jiān)測環(huán)境污染狀況利用染色體畸變和基因突變?yōu)橹笜吮O(jiān)測環(huán)境污染物的致突變作用1.生物群落法(生態(tài)學(xué)方法)利用生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化及生態(tài)系統(tǒng)功能的變化為指標監(jiān)測環(huán)境污染。（1）尋找指示生物（2）了解污染物對生物群落的影響例如：蝸蟲水蚯蚓一、生物監(jiān)測的主要方法2.毒理學(xué)方法和遺傳毒理學(xué)方法(1) 通過生物的急性、慢性毒性試驗來確 定污染物的毒性。毒理學(xué)方法：是以污染物引起機體病理狀態(tài)和死亡為指標監(jiān)測環(huán)境污染狀況。 (2) 為排放物尋找理論上的容許濃度（安全濃度）。3

3、.生理生化法 通過生物的行為，生長、發(fā)育以及生理生化變化為指標來監(jiān)測環(huán)境污染狀況。遺傳毒理學(xué)方法：是利用染色體畸變和基因突變?yōu)橹笜吮O(jiān)測環(huán)境污染物的致突變作用。 微核的變化、Ames試驗（1） 細菌學(xué)方法（2） 酶的活性（3） 種子發(fā)芽率（4） 魚的呼吸強度（5） 魚的回避4.生物化學(xué)成分分析法（殘毒測定法） 通過測定生物體內(nèi)污染物的含量，來估測環(huán)境污染程度。二、國外生物監(jiān)測動態(tài)1. 連續(xù)流動比例稀釋系統(tǒng)魚類生物學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)監(jiān)測槽呼吸信號放大器魚類行為、呼吸信號模擬器計算機稀釋系統(tǒng)理化分析監(jiān)測儀2.人工河流3.光合作用室4.利用激光自動鑒定硅藻種類界面萊塞計算機系統(tǒng)感謝觀看，歡迎批評指正中藥青蒿的

4、植物來源中華人民共和國藥典一九七七年前版均規(guī)定為菊科植物黃花蒿（Artemesia annua） 及青蒿（A. apiacea），二者的親脂性化合物成分存在很大差異，A. annua具抗瘧成分青蒿素，而在A. apiacea中則無此成分因而無抗瘧作用本草綱目中的附圖2.2 不同來源樣品分離的預(yù)處理樣品來源：植物、動物、微生物，例如：植物或動物的細胞培養(yǎng)液、微生物發(fā)酵液、動物血液、乳液和動植物組織器官提取液等。生物樣品中往往含有大量有機物、無機物及各種微量元素等，因此將目標物釋放到溶液中，對其進行初步富集和分離，對干擾組分進行初步去除等工作都屬于預(yù)處理。生物樣品的特征目標產(chǎn)物濃度普遍較低，懸浮液

5、大部分是“水”，組分復(fù)雜，是含有細胞、細胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類、無機鹽類等多種物質(zhì)的混合物；分離過程很容易發(fā)生失活現(xiàn)象，pH、離子強度、溫度等變化常常造成產(chǎn)物的失活；性質(zhì)不穩(wěn)定，易隨時間變化，如受空氣氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。2.2.1 植物組織中活性物質(zhì)的提取植物組織中所存在的酚類化合物使植物中提取生物大分子的過程變得復(fù)雜。植物組織被破壞時，蛋白質(zhì)等大分子和酚類處混合接觸狀態(tài)，很易發(fā)生反應(yīng)。酚類氧化產(chǎn)物醌類和單寧酸類會繼續(xù)和蛋白質(zhì)反應(yīng), 使目的蛋白失去活性。為此去除酚類化合物或避免反應(yīng)是必須進行的步驟。在提取酶、核酸、多糖等生物大分子時，其他大分子的存在會對提取產(chǎn)生干擾，需

6、要有效手段去除。預(yù)處理需要注意溫度盡可能低提取液的量要保證“充分浸入”加入足量酚類吸附劑加入足量氧化酶抑制劑攪拌轉(zhuǎn)速要恰當(dāng)pH要控制在合適范圍，一般5.57 酚類吸附劑的種類聚乙烯吡咯烷酮-可溶的（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮-不溶的（PVPP）：PVP和PVPP中的CON基有很強的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強聚乙烯和聚丙烯樹脂，如離子交換樹脂XAD-2、-4和-7聚苯乙烯的離子交換樹脂，包括陰離子交換樹脂（Bio-Rad AG1-X8,AG2-X8和Dowex-1）和陽離子交換樹脂（Dowex-50）Tris-硼酸 硼酸可與酚類靠氫鍵形成復(fù)合物，抑制

7、了酚類物質(zhì)的氧化及其與生物分子的結(jié)合 牛血清白蛋白（BSA）法 原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機會 其他聚合物如尼龍粉氧化酶抑制劑的種類抗氧化劑：2-巰基乙醇，二硫蘇糖醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇(DTE)，半胱氨酸(Cys)，抗壞血酸鹽前三種既是多酚氧化酶的抑制劑又是醌的清除劑抗壞血酸鹽在低濃度的醌存在下就很易被消耗，因此須在相對較高的濃度條件下使用（50 mmol/L）硼氫化鈉（NaBH4）是還原劑，可以還原醌2.2.2 動物組織預(yù)處理注意事項 勻漿前的預(yù)處理 (冷凍)提取緩沖液的選擇(緩沖物質(zhì)、pH

8、、離子強度)蛋白酶抑制劑的添加 蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶（如彈性蛋白酶，凝血酶，枯草桿菌蛋白酶，胰蛋白酶等），天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶四個家族，各有對應(yīng)的抑制劑，如常用的苯甲基磺酰氟（PMSF）是絲氨酸蛋白酶的抑制劑保護劑的添加(-巰基乙醇、EDTA、輔酶等) 提取液的澄清 (高速離心、沉淀、吸附等)2.2.3 微生物物質(zhì)的提取制備各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有所不同。有的發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有的產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。對于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相；對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收

9、集菌體或細胞，經(jīng)細胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細胞碎片分離。2.2.3.1 微生物發(fā)酵液預(yù)處理主要包括（1）發(fā)酵液雜質(zhì)的去除（2）改善發(fā)酵液的處理性能（1）發(fā)酵液雜質(zhì)的去除發(fā)酵液成分復(fù)雜，對提取影響較大的是高價無機離子、雜蛋白和色素物質(zhì)，影響后期離子交換、萃取、膜過濾、測定等無機離子的去除鈣離子：加入草酸形成沉淀，酸化發(fā)酵液，草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固鎂離子：加入三聚磷酸鈉可與之形成可溶性絡(luò)合物，可不再干擾離子交換鐵離子：加黃血鹽使其形成普魯士藍沉淀可溶性蛋白質(zhì)的去除鹽析等電點沉淀加熱法有機溶劑沉淀法吸附法其它沉淀法有色物質(zhì)的去除：常用脫色方法為吸附法，如活性炭吸附、樹脂吸附等（2）改善

10、發(fā)酵液的處理性能細菌及某些放線菌菌體細小，發(fā)酵液粘度大，往往不能直接過濾，直接用離心法除菌體，則能耗很大，應(yīng)用微濾的方法，又容易產(chǎn)生膜堵塞。需要通過一些簡單手段降低發(fā)酵液粘度，改善處理性能。降低發(fā)酵液的粘度的方法加熱法加水稀釋法調(diào)節(jié)pH值 因pH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)pH值可以改善過濾特性。細胞絮凝技術(shù)絮凝指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。通常需控制絮凝劑濃度保持在較窄的范圍內(nèi),如膠體的顆粒表面吸附大量的高分子物質(zhì),反而會在表面形成空間保護層。絮凝劑分類無機絮凝劑 無機鹽類絮凝劑(如硫酸鋁、硫酸亞

11、鐵、氯化鋁等) 無機高分子絮凝劑(如聚合氯化鋁、聚合鋁鐵等)有機絮凝劑 天然高分子絮凝劑(如淀粉的改性產(chǎn)物) 人工合成高分子絮凝劑 (如陽離子聚丙烯酰胺)無機與有機復(fù)合絮凝劑往往效果更好微生物絮凝劑具較好發(fā)展?jié)摿Γ饕远嗵恰⒍嗑郯被峄蛱堑鞍诪橹鳎€有少量的DNA和脂類絮凝劑絮凝效果與加入量、分子量和類型，溶液的pH值、攪拌速率和時間等因素有關(guān)絮凝機理（1）膠體理論 細菌可看做膠粒，因細胞表面的極性基團引起的表面吸附（2）高聚物架橋理論 細胞表面分泌的高聚物形成的胞外纖絲通過架橋交聯(lián)而使細胞絮凝（3）雙電層理論 細胞表面本身有電荷，加入的電解質(zhì)的排斥作用而促使細胞產(chǎn)生聚并作用2.2.3.2

12、大腸桿菌重組蛋白的提取制備多拷貝質(zhì)粒上強啟動子過量表達重組蛋白質(zhì)使整個細胞的蛋白質(zhì)表達水平提高，但大多情形下會導(dǎo)致諸如包含體的不溶性蛋白聚集的形成重組菌E. coli M15(pQE32-AGN)外源基因的誘導(dǎo)表達(A未誘導(dǎo)，B誘導(dǎo)) 重組蛋白的提取步驟大腸桿菌的酶解 采用溶菌酶或超聲破碎方法來破壁包含體的清洗 用溶劑清洗包含體能進一步除去雜蛋白從包含體中溶解重組蛋白（變性） 選擇和優(yōu)化溶解液（一般為尿素和鹽酸胍），使包含體中重組蛋白溶解重組蛋白的復(fù)性 稀釋法、透析法、層析法、分子伴侶等2.3 細胞的破碎與分離細胞的破碎 用一定方法（機械法、物理法、化學(xué)法、酶法等）打開細胞壁或膜，使細胞內(nèi)含物

13、有效地釋放出來提取 目的物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中。2.3.1 細胞的破碎方法2.3.1.1 機械法 原理：機械運動產(chǎn)生剪切力的作用破細胞組織搗碎利用高速旋轉(zhuǎn)的葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細胞破碎（1000020000 r/min）適用：動植物組織DS-1高速組織搗碎機(常用于實驗室規(guī)模)籠式粉碎機（工業(yè)規(guī)模）原理圖高速勻漿法特點 相對溫和，其機械剪切力對生物大分子的破壞較少，處理量大原理 利用高壓使細胞懸浮液通過針性閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)使細胞破裂適用 較柔軟、易分散的組織細胞高速勻漿法為大規(guī)模細胞破碎的常用方法，設(shè)備由高壓泵和勻漿閥組成高壓勻漿閥的結(jié)構(gòu) 不同規(guī)格的高速勻漿機研磨法與珠磨

14、法研磨法(實驗室規(guī)模) 由陶瓷的研缽和研桿組成，加入少量研磨劑（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土）研磨？特點：費時費力，規(guī)模小珠磨法(工業(yè)規(guī)模) 進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑1mg/ml（2）吸附法目的物濃度1mg/ml時可用此法（3）膜分離技術(shù)超濾屬加壓膜分離技術(shù)之一（4）干膠溶漲法加入具一定孔徑微孔能吸水的凝膠，如葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺方式：直接加入或在半透膜外吸收（5）多聚物吸水法PEG、PVP、CMC等具強大吸水力，可在半透膜外吸收（6）減壓蒸餾（真空旋轉(zhuǎn)濃縮）2.4 沉淀技術(shù)2.4.1 概念和分類概念 溶液中溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程本質(zhì) 通過改

15、變條件使膠粒發(fā)生聚結(jié)，降低其在液相中的溶解度，增加了固相中的分配率作用 分離、澄清、濃縮、保存沉淀方法分類鹽析有機溶劑沉淀等電點沉淀其他沉淀技術(shù) 非離子聚合物沉淀 生成鹽復(fù)合物 選擇性變性 親和沉淀2.4.2 鹽析2.4.2.1 原理“鹽溶” 低濃度中性鹽離子對蛋白質(zhì)分子表面極性基團及水活度的影響，增加蛋白質(zhì)與溶劑相互作用力，使其溶解度增大。“鹽析” 中性鹽濃度增加至一定值時，水分子定向排列，活度大大減少，蛋白質(zhì)表面電荷被中和，水膜被破壞，從而聚集沉淀。影響鹽析的因素鹽離子種類和濃度生物分子種類和濃度pH值溫度2.4.2.2 公式和討論純蛋白質(zhì)有鹽析經(jīng)驗公式： Log S = kSI S蛋白質(zhì)

16、溶解度（g/L）； I=0時logS，取決于Pr的性質(zhì)，溫度，pH； kS鹽析常數(shù)，取決于加入鹽的性質(zhì)及Pr性質(zhì)； I鹽濃度（mol/L）（通常不太用離子強度，高鹽濃度下不易計算）I單純Pr的鹽析1kSI的變化（kS鹽析）鹽、Pr一定，kS值一定，I 增加則S減小 2降低（ 鹽析）與Pr、溫度、pH有關(guān)pH：在Pr的pI時其溶解度較小溫度：在保證Pr不變性的條件下，溫度升高下降利于鹽析在不改變I的情況下改變pH或溫度將Pr沉淀3原始濃度PP小則鹽析所需I高，P大則鹽析所需I低 *對混合Pr的鹽析，P大，會發(fā)生嚴重共沉作用，一般控制濃度為2.53%混合Pr的鹽析1合適鹽析范圍的選擇 不同Pr鹽析

17、峰有重疊，須權(quán)衡純度和回收率2改變原始濃度 一種蛋白質(zhì)在不同濃度下的沉淀曲線會變化3二次鹽析 在原鹽濃度下二次鹽析，可除去易溶雜質(zhì)，但不能除去難溶雜質(zhì)二次鹽析除去易溶物2.4.2.3 鹽析操作要點（1）鹽的種類及選擇可使用的中性鹽有：(NH4)2SO4 Na2SO4 MgSO4 NaCl NaAc Na3PO4 檸檬酸鈉 等以(NH4)2SO4 Na2SO4最廣泛，前者最受歡迎（原因？缺陷？） 蛋白質(zhì)沉淀（鹽析）效應(yīng)增加陰離子：PO43, SO42, CH3COO, Cl, Br, NO3, ClO4, I, SCN陽離子：NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+,

18、 Ca2+, Ba2+蛋白質(zhì)促溶（鹽溶）效應(yīng)增加 （2）鹽析范圍的確定可采用鹽濃度對蛋白質(zhì)沉淀量的鹽析曲線測得（從回收率和純度考慮）（3）鹽的加入方式固體：緩慢加，防泡沫，要平衡液體（飽和鹽溶液）：要求鹽析范圍小于50%飽和度 *鹽析反應(yīng)完全需要一定時間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進行固-液分離確定鹽析范圍舉例試驗組別飽和度范圍酶沉淀(%)蛋白沉淀(%)純化倍數(shù)ABC04040606080800454570700484865654623226904107515252232213238303525400.162.81.00.0950.192.40.130.293.00.38取

19、小樣分段鹽析，從回收率和純度考慮來確定范圍（4）Pr的原始濃度太稀的蛋白質(zhì)溶液，不僅消耗大量中性鹽，對Pr回收也有影響；高濃度可節(jié)約鹽用量，但須適中，以避免共沉（5）鹽析操作的其他方法透析鹽析 將Pr溶液盛于透析袋中，放入一定濃度的鹽溶液中，由于滲透壓的作用，袋中鹽濃度連續(xù)性變化，使Pr沉淀 特點反抽提法（Back-Extraction） 將包括要分離的Pr在內(nèi)的多種Pr一起沉淀出來，然后選擇適當(dāng)?shù)倪f減濃度的硫酸銨來抽提沉淀物 特點（6）沉淀的再溶解將沉淀溶于下一步所需的緩沖液（12倍）2.4.2.4 脫鹽透析 *容器盡可能大，低溫、攪拌、常換液 （旋轉(zhuǎn)透析器、連續(xù)循環(huán)透析器）凝膠過濾層析 此

20、法脫鹽時間短，效果好超濾 膜分離技術(shù)根據(jù)所加操作壓所用膜平均孔徑的不同，可分為微濾、超濾、納濾和反滲透。利用超濾法把大分子中的小分子除去常用透濾模式。水2.4.3 有機溶劑沉淀2.4.3.1 基本原理 使溶液的介電常數(shù)大大降低，從而增加帶電粒子自身之間的作用力，易聚集沉淀；介電常數(shù)與靜電引力的關(guān)系，可用庫侖公式表示:爭奪酶、蛋白質(zhì)等物質(zhì)表面的水分子，破壞水化層，使分子易碰聚產(chǎn)生沉淀F=Q1Q2/2 有機溶劑水乙醇丙酮甲醇丙醇尿素（2.5mol/L）介電常數(shù)802422332384 相比較，有機溶劑脫水作用較靜電作用占更主要的地位 幾種溶劑的介電常數(shù)2.4.3.2 特點優(yōu)點：分辨能力比鹽析高,即

21、一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易缺點：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行2.4.3.3 沉淀條件溫度 生物大分子在有機溶劑中對溫度敏感，易變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)有機溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0以下，操作時要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過大溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機溶劑的揮發(fā)溫差分級沉淀pH盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點附近，以提高該沉析的分辨能力要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，少數(shù)生物分子在等電點附近不穩(wěn)定，影響其活性

22、盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生樣品濃度 樣品濃度低時增加有機溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果對于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機溶劑，減少了變性的危險，但共沉作用大，分離效果下降蛋白質(zhì)0.53，黏多糖12離子強度在有機溶劑和水的混合液中，當(dāng)離子強度很小，物質(zhì)不能沉析時，補加少量電解質(zhì)即可解決離子強度達一定程度時(0.10.2 mol/L以上) ，會增加蛋白質(zhì)或酶在有機溶劑中的溶解度，需大量的有機溶劑來沉析，并可能使部分鹽在加入有機溶劑后析出一般離子強度在0.05 mol/L或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對蛋白質(zhì)或酶起一

23、定的保護作用，防止變性多價陽離子的影響某些金屬離子具有助沉作用，蛋白質(zhì)與Zn2+、Ca2+等形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)在水和有機溶液中的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機溶劑的耗量0.0050.02 mol/L的Zn2+可使有機溶劑用量減少l/3至1/2使用時要避免會與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在有機溶劑的選擇 常用乙醇、丙酮、甲醇 溶劑用量V= V0（S2S1）/（100S2）分級沉淀 2.4.4 等電點沉淀2.4.4.1 原理等電點(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點的凈電荷為零時介質(zhì)的pH值，溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀

24、析出，此時溶質(zhì)的溶解度最低調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達到某一生化物質(zhì)的等電點，使其從溶液中沉淀析出而實現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點沉析技術(shù)2.4.4.2 注意事項等電點的改變目的物的穩(wěn)定性鹽溶作用pH的調(diào)節(jié)2.4.4.3 應(yīng)用在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點的特性來進行產(chǎn)品的分離純化等電點沉淀只適用于水化程度不大，在等電點時溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(pH=5.4)附近，難溶于水，能產(chǎn)生沉析；疏水性較大的蛋白質(zhì)（如酪蛋白） 可以與其他沉淀方法結(jié)合使用2.4.5 其他沉淀技術(shù)2.4.5.1 非離子多聚物沉淀法沉淀機理 基于體積

25、不相溶性，即聚乙二醇（PEG）類型的分子從溶劑空間中排斥蛋白質(zhì)，排斥體積與PEG分子大小的平方根有關(guān)，與被分離物質(zhì)無關(guān)常用的非離子型聚合物有PEG和PVP，PEG按分子量大小常用的有PEG 2000、PEG 4000以及PEG 6000PEG具有螺旋狀的結(jié)構(gòu)，親水性強，有很廣范圍的分子量，結(jié)構(gòu)式：HO-(CH2-CH2-O)n-H 低相對分子質(zhì)量的聚合物無毒，所以在一些臨床產(chǎn)品的下游加工過程中被優(yōu)先選用影響因素 PEG及其他非離子多聚物的沉淀效果除與本身的濃度、分子大小有關(guān)外，還受離子強度、pH和溫度等因素的影響2.4.5.2 選擇性變性沉淀熱變性沉淀（適用于對熱穩(wěn)定的物質(zhì)，注意防止目的物被酶

26、降解）pH變性沉淀（明確目的物酸堿穩(wěn)定性，注意控制溫度）有機溶劑變性沉淀2.4.5.3 生成鹽類復(fù)合物沉淀金屬復(fù)合鹽法有機酸復(fù)合鹽法2.4.5.4 親和沉淀2.4.6 應(yīng)用實例2.4.6.1 硫酸銨分級鹽析分離血清中主要蛋白質(zhì)材料新鮮動物血漿或血清（無溶血現(xiàn)象）：100ml離心機、大燒杯（500ml）、燒杯（250ml）高精度pH試紙、大容量瓶、移液管、玻璃棒等pH7.2飽和硫酸銨溶液0.2mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）清蛋白與球蛋白的分離取100ml血漿或血清置于500ml燒杯中，加PBS 100ml攪拌10min在攪拌下慢慢滴加200ml pH7.2飽和硫酸銨溶液加完飽和硫

27、酸銨溶液后繼續(xù)攪拌2030 min以充分沉淀球蛋白離心（3500r/min） 20min，轉(zhuǎn)移上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各種球蛋白各種球蛋白的分離用100ml PBS溶解上述沉淀中的各種球蛋白，并轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中攪拌15min在攪拌下慢慢滴加25ml飽和硫酸銨溶液，飽和度達20%離心（3500r/min）20min，沉淀含少量纖維蛋白質(zhì)，取上清液上清液在攪拌下，慢慢滴加1825ml飽和硫酸銨溶液，飽和度達3033%離心（3500r/min）20min得上清液（主要含-球蛋白和-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白和少量-球蛋白）取上一步的沉淀溶于PBS中使體積達100ml并轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中攪拌15min在攪拌下，慢慢滴加4350ml飽和硫酸銨溶液，約達3033%飽和度離心（3500r/min）20min得上清液（含-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白）取步驟5中上清液在攪拌下，慢慢滴加3540ml飽和硫酸銨溶液，飽和度約達45%離心（3500r/min）20min得上清液（主要為-球蛋白）和沉淀（主要為-球蛋白）2.4.6.2 乙