1、發育生物學Developmental Biology南通大學生命科學學院 朱道立緒 論第一節 發育生物學的研究對象、任務及其與其他學科的關系 發育生物學的研究對象、任務發育生物學與其他學科的關系發育生物學在生命學科中的地位一、發育生物學研究的對象、任務（一）對象發育生物學（developmental biology）：應用現代生物學的技術研究生物發育機制的科學。生物個體發育（ontogeny）：主要研究多細胞生物體從生殖細胞的發生、受精、胚胎發育、生長到衰老和死亡。也研究生物種群系統發生（systematics development）。1. 以多細胞生物個體發育為對象 主要研究多細胞生物體從

2、生殖細胞的發生、受精、胚胎發育(妊娠、出生)、生長、衰老和死亡,即使生物個體發育（ontogeny）中生命過程發展的機制。2. 研究多細胞生物的系統發生 研究生物種群系統發生(systematics development)的機制。（二）發育生物學的疑難問題發育生物學研究任務：分化問題；形態發生難題；生長難題；生殖難題；進化難題 發育生物學的任務：概括講，即在生物個體層次和系統層次上揭示發育機制問題。二、與其它學科的關系發育生物學是在胚胎學、細胞生物學、遺傳學、生物化學和分子生物學等學科發展的基礎上建立起來的一門新興的學科。特別是胚胎學對其貢獻最大。三、了解發育生物學的意義在理論方面：探討與人

3、類生存、健康密切相關的生命活動的奧秘。了解人類器官發生。在實踐應用方面僅舉3例：第二節 動物發育的主要特征和 基本規律嚴格的時間和空間的秩序性基本規律發育時空秩序性的控制機制一、主要特征：具有嚴格的時間與空間的次序性。這種次序性是由發育的遺傳程序控制的。爪蟾個體發育的主要階段和生活史。這是一個正常的遺傳程序控制的例子。但在異常情況下，如受到不良環境刺激，或機體代謝紊亂，產生錯誤代謝產物，特別是蛋白質、酶類后，會改變細胞基因的表達，導致發育程序紊亂，就會危及動物的生存（如基因突變、遺傳缺陷、癌變等）。二、動物發育的基本規律動物共同的發育階段：一般從受精開始，到最后的組織器官形成，發育為幼體，再通

4、過生長發育成為成體。（一）配子發生（gametogenesis）配子發生是在睪丸生精細管和卵巢內進行的。 （二）受精(fertilization) 精子與卵子結合形成雙倍體合子的過程叫受精。受精是胚胎發育起始。 （三）卵裂(cleavage)受精卵體積較大，個體發育由此開始。卵裂過程的明顯的特點是：不同于一般的細胞分裂，一般的細胞分裂MG1SG2M，有一個生長過程。而卵裂時，細胞沒有生長期，只有MSMS，故卵裂球越分裂越小。（四）囊胚（blastula）桑椹胚細胞分泌液體，使細胞間出現空的腔隙，由小腔隙匯合成大腔隙，細胞向周圍排列，形成中空的球體，稱囊胚。（五）原腸胚（gastrula） 外胚

5、層神經系統（腦、脊髓）、表皮、晶狀體、毛、齒、甲、爪等；中胚層骨、軟骨、循環系統（心臟、血細胞）、性腺（泌尿生殖系統）、結締組織等；內胚層呼吸系統、咽（甲狀腺和甲狀旁腺）、消化道（消化腺、肝、胰等）。（六）神經胚形成（neurula） 在中胚層尚未完全形成時，胚胎背中部的外胚層細胞增殖并加厚，形成神經板，從兩側向上向內卷曲形成神經褶。兩側神經褶在中間匯合形成神經管。（七）組織和器官原基的形成(anlage formation of histogenesis and organogenesis) 組織和器官原基的形成牽涉到兩個過程， 其一是圖式形成；其二是細胞分化。1. 細胞分化（cell di

6、fferentiation）。細胞從一個受精卵經過分裂和分化，形成結構形態和功能各不相同的各類型細胞的過程叫細胞分化。圖式形成最初涉及多種細胞生物形體模式（body plan）：主要包括胚軸形成(axisation)、體節形成（segmentation）、肢芽和器官原基（anlage）形成等事件。卵子（Oocyt） 精子 （Sperm）受精（fertilization）卵裂（cleavage）原腸作用（gastrulation）器官形成（organogenesis）囊胚（Blastula ）合子（Zygote）原腸胚（Gastrula）神經胚形成（neurulation）神經胚（Neurula

7、）幼蟲（Larval） 成體（Mature adult） 變態( metamorphosis)胚胎發育三、極性在發育過程中的作用胚胎發育早期：整體構架即軀體的體軸；卵黃分布不均等性使受精卵分為動物極和植物極；各種蛋白、mRNA等物質的濃度不相同等；兩側對稱的動物，胚胎發育首先要決定的是身體的前后、背腹及左右三個體軸。（一）灰色新月為細胞正常發育所必需（空間極性問題）。 （二）發育的循序漸進和細胞命運的決定（時間極性） 第三節 發育生物學的發展簡史（自學）后成論與先成論 細胞理論對胚胎發育和遺傳概念的影響 發育的嵌合型和調整型誘導的發現 遺傳學和與胚胎學的結合 分子生物學與發育生物學的結合 第四

8、節 發育生物學模式生物脊椎動物模式生物:非洲爪蟾, 斑馬魚, 雞, 小鼠 無脊椎動物模式生物:果蠅, 線蟲發育生物學研究技術常用發育生物學研究技術 發育遺傳學技術 正向遺傳學技術 反向遺傳學技術 一、常用發育生物學研究技術（一）顯微鏡技術顯微鏡和解剖鏡是必備工具，相差顯微鏡（phase contrast microscope）、微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope）：適用于觀察活的或未染色樣品的精細結構。激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope）利用熒光染料標記的特異性抗體

9、或探針，對胚胎或細胞中的特定蛋白或mRNA的分布進行定性和定量研究。（二）組織切片技術觀察到胚胎的內部結構，通常進行組織切片：石蠟切片技術。冷凍切片是利用特殊的低溫包埋劑對樣品進行包埋，在低溫條件下進行切片的技術。振動切片機可以切新鮮的或經過固定的動、植物標本，但切片較厚，不適于精細結構的觀察。（三）分子生物學技術聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR），反轉錄PCR（RT-PCR），Northern印跡雜交，Western印跡雜交，免疫共沉淀技術常用于檢測目的基因或蛋白質在某一發育時期或特定組織中的表達。抑制性差減雜交技術：其基本原理是以抑制PCR為基礎的

10、DNA差減雜交。（四）原位雜交技術胚胎原位雜交：用于胚胎發育調控基因表達研究。原理是用各種標記物標記與體內特定mRNA互補的RNA分子（反義RNA），以它們作探針與動物的整體胚胎進行原位雜交，然后用相應的抗體來檢測特異探針的分布。（五）顯微注射顯微注射技術常用于將外源DNA、RNA或標記物等導入早期胚胎細胞中。（六）報道基因技術常用于啟動子/增強子的分析研究。常用的報道基因有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和lacZ基因。（七）細胞標記技術在發育生物學實驗中經常會用到細胞標記技術，如對胚胎早期卵裂球分化命運圖譜的研究，在胚胎移植實驗中標記供體或受體組織

11、，在顯微注射實驗中追蹤被注射卵裂球的命運與表型等。細胞內標記物常用的是熒光標記葡聚糖和辣根過氧化酶，通過顯微注射導入細胞內，經過熒光顯微鏡或組織化學方法進行定位。二、發育遺傳學技術（一）正向遺傳學技術1.大規模誘變篩選射線或化學誘變劑處理父本個體，在生殖細胞產生隨機突變，與野生型母本個體雜交，子一代（F1）個體攜帶基因突變。F1的每一個體再與野生型個體雜交，產生每一子二代（F2）群體內雜交。如F1個體攜帶基因突變，F2個體中就會有一半個體是雜交突變體，在F3代中有1/4的交配組合后代出現純合突變個體而表現出某種發育異常。2.插入誘變篩選（insertional mutagenesis scre

12、en）利用轉座子（transposon）或病毒載體作為誘變劑。在果蠅中常用P-因子轉座子，反轉錄病毒是一類RNA病毒。3.突變基因的克隆多數情況下采用定位克隆（positional cloning）的辦法。較常用的分子標記檢測手段包括簡單序列長度多態性、限制片段長度多態性和單核苷酸多態性分析。可以將突變基因定位到幾百千堿基的范圍內。再獲取該染色體片段的基因組序列。過去通常要采用染色體步行或染色體跳躍來進行。（二）反向遺傳學技術1.基因敲除技術（gene knock-out）基因敲除是獲得攜帶有特定基因突變個體的技術，基因敲除技術是研究基因在發育中的功能的重要方法。2.條件基因敲除技術（cond

13、itional knockout）通常采用的是Crelox系統。Cre編碼一種重組酶，可以識別并結合loxP位點并切除位于兩個loxP位點之間的序列。要進行條件基因敲除技術需要構建兩個小鼠品系，在其中一個品系中在靶基因兩側都插入loxP位點，在另一個品系中需要轉入由組織特異性啟動子控制的cre基因。如果將這兩個小鼠品系進行雜交，其后代小鼠中，cre會在特定組織中表達，在這些組織中，靶基因就會被Cre切除而失活，從而實現組織特異性的基因敲除（圖緒. 16）。3.RNA干擾技術抑制某一特定基因的表達是研究基因功能的重要方法。RNAi的作用機制如圖緒.17所示。在RNAi過程中，長的dsRNA首先被

14、一種RNA酶III（Dicer）裂解為2123個核苷酸的小干擾dsRNA（small interfering RNA， siRNA），這些siRNA帶有5端磷酸基團和3端的羥基，3末端帶有23個突出的核苷酸。siRNA近而結合到一種蛋白復合體中，形成RNA誘導的沉默復合體（RNA induced silencing complex，RISC）。雙鏈siRNA解旋，RISC利用其反義鏈識別同源mRNA并在配對區是中間將目標mRNA水解，從而導致特異性的基因表達抑制。4.嗎啉代寡聚核苷酸（morpholino oligonucleotides，MO）MO是利用反義寡聚核苷酸抑制特定mRNA的翻譯而

15、阻斷目的基因功能的方法。5.顯性抑制（dominant negative）顯性抑制即通過過量表達顯性抑制型蛋白以阻斷內源蛋白活性，通過某種修飾或加工抑制野生型蛋白功能的缺陷性蛋白。6.轉基因技術（1）將外源基因直接注射到受精卵的細胞核中。（2）通過胚胎干細胞介導。7.基因捕獲（gene trap）與增強子捕獲（enhancer trap）是一種報道基因轉基因技術，基因捕獲技術采用的轉基因結構包含3部分：1個剪切位點、1個報道基因和1個可篩選基因（如抗藥性基因，圖緒.19）。8. 果蠅中的克隆化分析（clonal analysis）克隆化分析用于在胚胎特定組織中誘導產生帶有某一基因突變或過表達的

16、細胞群，以精確分析某些基因或信號途徑在發育過程中的功能。這一方法常用于果蠅成蟲盤研究。克隆化分析是基于FLP重組系統的。 主要參考書Gilbert S.F., Developmental Biology, 2000, 2019, 2019, 6-8th Edition, Sinauer associates, Inc. Sunderland, Massachusetts, U.S.A.Wolpert L, et al., 2019, Principles of Development, Second Edition，Oxford University Press，Twyman,R.M., 20

17、19, Instant Notes in Developmental Biology, BIOS Scientific Publishers Limited.Twyman RM. , 2019, Instant Notes in Developmental biology. BIOS Scientific Publishers LimitedBalinsky,B.L.,1975, An Introduction to Embryology, 4th Edition, Saunders Company, london.Twyman RM. , 2019, Instant Notes in Developmental biology. BIOS Scientific Publishers Limited相關網絡資源 /Developmental Biology Tutorial: The Virtual