1、 阿爾茨海默病與Wnt /-catenin 信號途徑學習（learning）指我們獲得新知識或新技能的過程。記憶（memory）指將這種知識或新技能編碼、儲存及隨后讀出的過程。海參(aplysia)有簡單的神經系統（20000個神經細胞）和一個腮回縮反射用于研究學習記憶Eric Kandel 2000年諾貝爾生理/醫學獎美國哥倫比亞大學爐架噴水管 溫和刺激 噴水管 鰓和噴水管收縮 (縮鰓反射)短期記憶：幾分鐘幾小時弱刺激 cAMP PK 特定的離子通道蛋白磷酸化 Ca2+ 進入 神經遞質釋放短期記憶長期記憶：幾個星期 強刺激 cAMP PK 不同蛋白磷酸化 產生新蛋白質 突觸結構功能改變(形狀

2、增大，突觸功能持久增強) 神經遞質釋放 長期記憶如果新蛋白質合成被阻止長期記憶將消失，短期記憶不受影響。老化(ageing)：老化是一種生理過程，指的是增齡變化。衰老(senility) ：衰老是一種病理改變，是指過早、過快出現老化改變。衰老是生命發展的后一階段，主要指有機體性成熟后所發生的與時間有關的各種改變。在此階段中形態結構出現衰退現象，伴隨著功能的下降，有機體對環境的應激能力也相應減弱 。 腦老化：是人體增齡過程中，神經元緩慢發生的退行性改變(神經原群體缺失和包涵體的形成)，表現為腦體積減少，神經功能減退，不能有效維持機體的內環境恒定和對外環境的適應能力降低。神經系統老化表現：（一）腦

3、的大體改變 腦組織出現腦回縮小、腦溝變寬，以額、顳、頂葉為最明顯。由于腦體積減少，含液體的腔隙增加，使腦體積和顱腔容量的比例逐漸下降。腦膜松弛，側腔室擴大，特別在半卵圓中心，可出現腦室角變鈍，第3、4腦室和大腦導水管也可擴大。（二）細胞水平的改變 神經元在生后停止分裂，即數目不再增加。現在認為很多神經元變小、萎縮的增齡變化是腦體積減少的主要原因。大多數腦干顱神經如耳蝸、滑車、外展和面神經核的神經元數不隨增齡而改變，但在兒茶酚胺能的神經核團中，在藍斑復合體、黑質和迷走背核的神經數目隨年齡而減少，但背縫核的無改變。 在下丘腦、乳頭體無神經元丟失，視上核和室旁核的細胞密度無改變，而含加壓素的視交叉核

4、和性二形性的神經原隨年齡而減少。但它們含血管活性腸肽的細胞數沒有改變。（三）分子水平改變 神經元在分子水平上的增齡改變，主要表現在兩個方面：老年斑（senile plague, SP) （細胞外）神經元纖維纏結（Neurofibrillary tangle, NFT)的形成（細胞內）它們可在青壯年時出現，且逐漸增加，百歲老人的發生率可達100%。 阿爾茨海默病(Alzheimer,s disease, AD)阿爾茨海默病(AD) 是病因未明的原發性退行性腦變性疾病。多起病于老年前期或老年期，潛隱起病，緩慢進展，以智能損害為主。病理改變主要為皮層彌漫性腦萎縮，神經元大量減少，并可見老年斑、神經元

5、纖維纏結、顆粒性空泡小體等病變. 我國65歲及以上老人占總人口的比例從1990年的 5. 57%增至2000年的6. 96%, 現已達8 811 萬。我國目前老年期癡呆的患病人數約占全世界老年期癡呆患者的1 /4。但這些患者的就診率非常低。病程20年，早期9年，中度5年，惡化6年。死亡率占第四（心臟病，腫瘤，中風）智力、記憶、感覺、定向判斷能力不可逆退化，進行性遠近記憶力障礙，情緒改變，行為異常，意識模糊。死于肺炎，尿路感染等。在9月21日世界阿爾茨海默病日(世界老年癡呆日) 。 AD的病理性結構改變：細胞內神經原纖維纏結(NFT) : NFT沉積在 海馬、新皮質的錐體細胞等；細胞外老年斑（S

6、P） : 彌散性老年斑 A蛋白聚集，海馬、額葉皮質；1.老年斑（SP） SP主要由淀粉樣肽（- amyloid, A）沉積而成。A由3943個氨基酸組成，它來自相對分子質量大的前體蛋白（- Amyloid precursor protein, APP)。APP由695個氨基酸組成（APP695），包括有神經保護作用的NTF(N- C-terminal fragment)和有神經細胞毒的CTF兩部分（C-terminal fragment）。NTF即sAPP(可溶性APP)，具有促進神經軸突生長、突觸形成的功能。 A的沉積與年齡成正比。-site APP cleaving EAPP（- amyl

7、oid precursor protein）高爾基體N-O-鍵處糖基化、硫化、磷酸化細胞膜跨膜蛋白，腦、肺、腎、肌、脾等-淀粉樣前體蛋白APP的功能：1.蛋白酶抑制劑；2.促進細胞生長、繁殖；3.促進細胞與細胞、細胞與基質間的粘著；4.細胞表面的受體，與肝素 和某些金屬離子結合。A (amyloid -peptide,-淀粉樣肽)的生成： APP(695AA) 某些蛋白酶降解(、分泌酶) A (3942AA)APP由兩條通路切割: -分泌酶介導;生成非病理肽,發生在磷脂豐富區 ,-分泌酶介導;生成A,發生在鞘磷脂/膽固醇豐富區(Non-pathogenic peptide)微纖維形成AAA紅色

8、的為老年斑，綠色為小神經膠質細胞 microglia）具有重要生理功能 APP分子內信號即是A，A是APP正確轉運所必需的肽段，具有重要生理功能： a.神經營養作用：正常生理濃度時，促進神經突起生長，神經營養； b.膽堿神經原的調節物質; c. APP經軸突運輸的信號 抑制膽堿能神經元攝取膽堿和抑制膽堿乙酰轉移酶ChAT（膽堿乙酰輔酶A乙酰膽堿+輔酶A ）活性，使乙酰膽堿合成減少 A是膽堿能神經元的神經調節物，可對膽堿能性神經元造成損害，使突觸丟失和神經原功能低下，神經元皺縮變小，甚至死亡。許多神經元體積變小是腦老化的重要特征。也是App軸漿轉運的信號。樹突萎縮，軸突回縮變厚，胞體樹突間出現空

9、泡樣包含體2.神經毒性作用： 高于營養濃度 晚期神經元A毒性作用機制： 抑制神經元對葡萄糖的攝取， 增加谷氨酸的釋放， 胞內鈣穩態破壞、胞內Ca2超載， 影響M1受體后信息轉導， 細胞活性氧產生， 對各種傷害性刺激反應增強，神經細胞的退行性變性可能是新的細胞死亡形式neurodegenerasis）；如同神經細胞凋亡。A的間接毒性可經某些離子中介： A Ca 2 Tau蛋白磷酸化 PHF(成對螺旋纖絲)生成A與AD AD(血管損傷和癡呆) A聚集 與其他蛋白結合并激活許多蛋白質 刺激自由基產生 或連接死亡通路 或刺激細胞正常功能所需要的因素,如蛋白酶體 癡呆2.神經元纖維纏結（neurifib

10、rillary tangles,NFT） Alzheimer病(AD)是成人癡呆癥中最常見的一種。神經細胞內的神經元纖維纏結(NFT)是其特征性腦損傷之一 是神經退行型疾病的細胞內標志. 神經元纖維纏結主要成分是成對螺旋纖絲（Paired helical filament，PHF）。 Tau神經細胞的主要微管相關蛋白 (microtubule associaed protein，MAP） 泛素PHF(1)Tau蛋白 一種分布在中樞神經系統內的低分子量含磷糖蛋白； Alzheimers型老年癡呆患者腦中存在大量異常修飾Tau蛋白，其對AD病理過程發生有重要作用，腦脊液中的某些磷酸化tau（p-t

11、au）蛋白水平可用于Alzheimers病與其他癡呆的鑒別診斷。到目前為止，p-tau蛋白是最佳的Alzheimers病的檢測標志。 由細胞骨架功能障礙改變骨架結構,造成受影響的基因產物堆積而引起的疾病-細胞骨架病.正常tau蛋白可分兩種:低分子量tau蛋白(LMW-tau)： 在中樞神經系統內(45006 000) 高分子量tau蛋(HMW -tau)： 在周圍神經系統中(9000), 這兩種tau蛋白均由定位在17號染色體長臂上的 基因編碼而成. 由于轉錄產物mRNA在轉錄后剪切修飾過程中的差異, 可形成6種異構體. 最小的異構體包含352個氨基酸, 最大的異構體有 441個氨基酸6種異構

12、體 Tau蛋白在神經原元胞體內合成，經修飾后即磷酸化后進入軸突，與微管蛋白組裝成有功能的微管。 Tau蛋白功能： 誘導與促進微管蛋白聚合成微管； 與新聚合的微管束縛在一起, 防止解聚, 維持其結構的穩定性。 參與維持細胞形態、信息傳遞、細胞分裂及運動等重要生物學過程。是軸突生長發育和神經原極性形成的不可缺少的因素。 PHF以右手螺旋盤旋而成的雙螺旋絲結構 直徑22-24nm,每80nm處有一狹窄區,直徑 10nm. PHF在電鏡下是單個螺旋絲 PHF在電鏡下是纏結形式存在成對螺旋纖絲（ Paired Helical Filament, PHF)AD tau 有三個級分:1.胞漿非異常修飾tau

13、(C-tau);2.異常修飾易溶性tau(AD-tau);對calpain（鈣蛋白酶） 抗性增加3.異常修飾并聚集PHF的tau(PHF tau). PHF在電鏡下是單個螺旋絲 PHF在電鏡下是纏結形式存在,蛋白被泛素化修飾 當tau蛋白發生高度磷酸化、異常糖基化、異常糖化以及泛素蛋白化時,形成NFT。 tau蛋白失去對微管的穩定作用, 導致神經纖維退化, 從而引起神經功能失調。正常Tau蛋白形成NFT與下面幾個原因密切有關：過度磷酸化：糖化和糖基化截斷作用 -突觸核蛋白NFT形成過程過度磷酸化： 正常tau蛋白每分子含2個磷酸基，而PHF-tau蛋白異常磷酸化位 21個。正常tau蛋白 2-

14、3Mol磷酸/M tau，AD-tau 5-9Mol磷酸/M tau 保持tau蛋白磷酸化的正常范圍是需要蛋白磷酸激酶和蛋白磷酸酯酶二組酶活性保持相對穩定。研究表明，磷酸酯酶活性降低可能與tau蛋白過度磷酸化有關。 微管結構破壞,正常軸突轉運受損引起突觸丟失,神經元功能受損,發生神經退行型病變. tau蛋白磷酸化： AD發生時可能有幾種蛋白激酶參與Tau蛋白的異常過度磷酸化 ：體外可使tau磷酸化的有： 1.PKA : 可參與tau的過度磷酸化、PHF和NFT的形成 ； 2. CaMK可催化tau蛋白262位絲氨酸發生磷酸化，但只抑制其促微管組裝活性的40%; 3. GSK3 （糖原合酶激酶）

15、 4. MAPK（絲裂原激活蛋白激酶）？ 5. CDK5（cyclindependent kinase 5）？成對螺旋纖絲異常磷酸化的tau蛋白不易被CANP (鈣離子激活中性蛋白酶)水解,去磷酸化降低tau蛋白對CANP的抵抗性。 糖化和糖基化糖化(Glycation) 是指蛋白質分子自身的-NH3與細胞內糖類物質的醛基，經氧化形成Shiff堿，再經分子內重排而形成不溶性的交聯物。 糖基化(Glycosylation)指在特定的糖基轉移酶作用下，糖基通過共價鍵與蛋白質形成糖蛋白。 研究證明，AD發生時tau蛋白與糖化和糖基化有關的修飾。截斷作用(truncation) 指tau蛋白N端或C端

16、被酶切除而使分子變短的過程。截斷后 的tau蛋白易于形成二聚體，失去與微管蛋白結合的能力。 在實驗性小腦顆粒細胞的凋亡過程中出現了17103的可溶性、脫磷酸的片段，造成微管破裂、細胞凋亡，這個過程中主要由calpain(鈣蛋白酶)和caspase-3依賴的蛋白裂解引起和6869103的PHF tau相對增加所觸發。所以tau蛋白截斷是細胞凋亡和PHF形成過程中的重要環節之一。 -突觸核蛋白( -synuclein，SNCA)： 1993年，Ueda等在人類阿爾茨海默病(AD)淀粉樣斑塊中的非AD蛋白成分中分離得到一種新的蛋白質，并命名為非-淀粉樣蛋白組分， 一種豐富 細胞內蛋白質,在突觸尤其豐

17、富,可能作為分子伴侶,調節PKC,PLD等, 聚集對神經元有毒性， 已在SP中發現，它由140個氨基酸組成，其中6195的35個氨基酸肽段可與 A結合，促進A沉積。這種肽段在SP中的含量可達A的10%。NFT形成過程 NFT的主要成分是成對螺旋纖絲（PHF）。PHF的主要亞單位是過度磷酸化的Tau蛋白。過度磷酸化是形成PHF的最起始的步驟。過度磷酸化的Tau蛋白喪失與微管蛋白組裝為微管的能力。雖然這種Tau蛋白脫磷酸后仍可恢復結合微管蛋白功能，但卻易于聚合成PHF。 在過度磷酸化的基礎上，Tau蛋白發生糖基化和糖基化修飾，從而形成對酶解有抵抗的交聯物。Tau蛋白截斷也可能與過度磷酸化關系不大。

18、神經元由于微管破壞，功能丟失，導致神經原死亡。而NFT仍殘留在形成的部位，成為永久性的標記。神經原纖維纏結Neurifibrillary tangles(NFT) NFT（神經元纖維纏結）癡呆 腦老化的可能機制（一）代謝紊亂 1.氧化應激-第一要素： 誘導神經元死亡而致:自由基氧化導致DNA突變、脂質氧化等。分裂細胞不斷地更新器官有助于降低氧化反應的影響，而神經元不能分裂，氧化產物不斷積累。 2.蛋白質聚集第二要素： 蛋白質糖化和各種原因引起的大分子物質的交聯蛋白聚集物的穩定積累對神經元的進行性刺激,引起穩定的進行性的損傷和細胞死亡。 A、Tau蛋白聚集導致與其他蛋白結合并激活許多蛋白質,進而

19、刺激自由基產生或連接死亡通路或刺激細胞正常功能所需要的因素,如蛋白酶體。 3.DNA和RNA改變。線粒體DNA不穩定，點突變比正常人高，導致海馬區出現凋亡。A可結合神經元上的許多蛋白質，有些蛋白質與細胞死亡級聯反應連接，如p75NGFR、RAGE受體、型清除受體等。A與 p75NGFR的結合刺激JNK介導的細胞應激反應和Caspase9介導的凋亡反應。RAGE受體( 高級糖化終末產物受體)清除已被非酶催化的糖基化反應的蛋白質（非酶催化的糖基化反應發生在自由基和蛋白質間的共價反應）。尤其小膠質細胞攝取A作用比神經元更強。 高級糖化終末產物受體-清除已被非酶催化的糖基化反應的蛋白質NMDA rec

20、eptor：N甲基D天冬氨酸受體2O2+ 2H+ SODH2O2 + O2 H2O + O2 過氧化氫酶SOD：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase)消除自由基： 谷胱甘肽過氧化物酶 H2O2(ROOH) H2O(ROH+H2O) 2G SH G S S G NADP+ NADPH+H+ 谷胱甘肽還原酶 含硒的谷胱甘肽過氧化物酶 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase)（二）代謝產物清除障礙1.少量NFT與泛素結合：AD病人PHFTau增加幾百倍，泛素亦增加，但它們成為NET 的成分，N

21、FT對酶降解抵抗不能清除。2. 2巨球蛋白（ 2 M）：可與A結合而不形成沉淀或纖絲。 2 M與受體結合后，可將與 2 M結合的A內化而降解。3.神經存活因子活性降低：神經營養因子、神經生長因子等活性降低。Neuronal Wnt /-catenin 信號途徑 與AD的發生 1982年在小鼠乳腺癌發現了Wnt基因，由于此基因激活小鼠乳腺癌相關基因的插入（insertion），最初命名為Intl癌基因。后發現該基因在小鼠的正常胚胎的發育中起重要作用，相當果蠅的無翅(Wingless）基因，其編碼的蛋白在細胞間傳遞生長和發育信息，可控制胚胎軸向的正常發育。將Wingless與Intl結合稱為Wnt

22、基因。人的Wnt基因位于12q13。 Neuronal Wnt /-catenin (-鏈蛋白) 信號途徑Wnt 信號途徑 在細胞黏附,細胞分化等方面起重要作用,參與胚胎發育,細胞生長調節等過程. 1. Wnt 信號與器官發生：參與海馬回、中腦、大腦的發育、生長錐的重建、肢體起始、頂端外胚層建立等； 2. Wnt 信號與細胞特化和干細胞：皮膚干細胞、腸細胞、脂肪細胞、造血細胞的分化； 3. Wnt 信號與腫瘤發生：乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤、原發肝癌等。Wnt有四個分支:1.典型Wnt/ -catenin 信號通路;2.平面細胞極性通路；2+通路：激活PLC、PKC；4.調節紡錘體方向和非對稱細

23、胞分裂的胞內通路Wnt/-catenin 信號途徑的主要成分： 1.Wnt被稱為形態發生素（morphogen）,細胞外因子是胚胎發育過程中調節細胞生長、移動和分化的旁分泌性糖蛋白， Wnts通路的許多組分在腫瘤形成中也起作用.2.跨膜受體Frizzled，Fzd：卷曲蛋白，為7次跨膜蛋白，結構類似于G蛋白偶聯型受體 3.輔助受體-LRP5/6 （低密度脂蛋白受體相關蛋白-5和-6，） 4.蓬亂蛋白（Dishevelled，Dsh/Dvl），Dsh能切斷-catenin的降解途徑5.軸蛋白（Axin）：是一種支架蛋白，具有多個與其它蛋白作用的位點，能將APC、GSK-3、-catenin、CK

24、1結合在一起。因此屬于Wnt途徑的正調控因子（conductin）。6. APC：是一種抑癌基因，其突變引起良性腫瘤結腸腺瘤樣息肉（adenomatous polyposis coli），APC蛋白的作用是增強降解復合體與-catenin的親和力。7. GSK-3(糖原合酶激酶，glycogen synthase kinase-3) 是一種蛋白激酶，在沒有Wnt信號時，GSK-3能將磷酸基團加到-catenin氨基端的絲氨酸/ 蘇氨酸殘基上，磷酸化的-catenin再結合到-TRCP蛋白上，受泛素的共價修飾，被蛋白酶體(proteasome）降解。 8.-catenin (-鏈蛋白）是一種多功

25、能的蛋白質，在細胞連接處將鈣粘蛋白與細胞骨架連接起來，參與形成粘合帶，穩定細胞黏附功能；而游離的-catenin可進入細胞核，調節基因表達. 9. TCF- T細胞因子10.LEF(lymophoid enhancer factor)-淋巴細胞增強因子11. CK1：酪蛋白激酶（casein kinase 1），能將-catenin的Ser45磷酸化，隨后GSK-3將-catenin的Thr41、Ser37、Ser33磷酸化 胞膜中-cat大部分與胞膜上鈣黏蛋白（cadherin）的胞內段及胞內的-cat結合，使之附著于細胞骨架蛋白肌動蛋白（actin）上，介導同型胞間黏附。 Catenin細

26、胞質膜: 介導鈣粘著蛋白與微絲骨架連接-同型胞間 黏附；細胞質: 已可溶性分子自由存在核內: 與TCF (T細胞因子),LEF(淋巴細胞增強因子) 等 轉錄因子結合三種-catenin-Catenin-Catenin-Catenin胞膜中-cat大部分與胞膜上鈣黏蛋白（cadherin）的胞內段及胞內的-cat結合，使之附著于細胞骨架蛋白肌動蛋白（actin）上，介導同型胞間黏附。-cat磷酸化增加與泛素結合降解，胞質內含量減少-cat是Wnt通路的關鍵成分。 1. 正常無Wnt信號時，胞膜中-cat大部分與胞膜上鈣黏蛋白（cadherin）的胞內段及胞內的-cat結合，使之附著于細胞骨架蛋白

27、肌動蛋白（actin）上，介導同型胞間黏附； 2.少部分與胞質內APC蛋白、GSK-3、軸蛋白（axin）等結合成多蛋白復合體，參與Wnt信號通路調節細胞增殖。Fzd受體活化Dsh/Dvl蛋白 GSK-3活性 -catenin磷酸化Wnt 信號存在胞質-catenin含量升高-catenin積累進入核內與TCF,LEF等轉錄因子結合靶基因表達細胞增殖 細胞凋亡Wnt信號減弱GSK-3 活性胞質-catenin磷酸化Tau蛋白磷酸化泛素化降解胞質-catenin含量A 阻斷Wnt-靶基因表達神經元死亡 Wnt信號正常， GSK-3 活性降低： 胞質-catenin含量升高 ，促進增殖 Tau蛋白

28、磷酸化減少， A 生成減少Wnt信號減弱 ，GSK-3 活性升高 胞質-catenin含量下降，促進凋亡 Tau蛋白磷酸化增強，A 生成增加，抑制AD發生促進AD發生Neuronal Wnt /-catenin信號途徑 及對抗A 毒性的神經保護因素 AD時，Wnt信號減弱, GSK-3 活性增加,導致神經退行性病變,神經元死亡. 1. Li+ GSK-3 的抑制劑 作為神經保護劑通過Wnt /-catenin信號途徑 對抗Tau蛋白的磷酸化,抑制胞質-catenin磷酸化，防止過渡降解及抗凋亡,穩定微管系統。 鋰鹽激活Wnt信號,可能用于AD的長期治療. 正常時-catenin主要存在于胞質,

29、核里少;A 增加后,胞質的-catenin明顯減少; 加入Li+ 和AchE(膽堿酯酶)后,胞漿-catenin明顯增加， -catenin進入核激活Wnt信號通路,抗凋亡.cA+AchEA+AchE +Li-CatFig. 4 A 、A-AchE和Li影響胞質 catenin含量B.Immunoblot of -catenin-Fig. 4. Amyloid and amyloidAChE complexes destabilized cytosolic -catenin. Seven-day-old cultured rat hippocampal neurons (95% pure ne

30、urons) weretreated with amyloid or amyloidAChE complexes (5 M) in the absence or presence of 100 M lithium chloride. (A) -catenin immunofluoresence ofuntreated neurons (top panel) or neurons treated with amyloidAChE complexes in the absence (middle panel) or presence of lithium (bottom panel). (B)Im

31、munoblot of -catenin in nuclear and cytosolic fractions. The neurons were treated with amyloid or amyloidAChE complexes in the absence or presence of lithium and both cytosolic and nuclear -catenin were analyzed by Western blot. The signal was quantified by densitometry and the values were expressed

32、 with respect to untreated cells.2. PPARs(過氧化物酶體增殖激活受體-類固醇受體) 是調節脂肪分化的重要調節物,其通過Wnt/-Catenin 途徑發揮保護作用. TGZ（Troglitazone）-PPARs的激活劑對凋亡刺激有調節作用,有神經保護作用. TGZ可使胞漿的-catenin增加,減少A引起的神經毒性，促進神經末梢分化。使胞漿-cat增加，使神經元存活能力加強。TGZ為PPARs的激活劑；GW9662 PPARs的抑制劑Fig. 6. PPARs的激活劑-TGZ增加胞質-cat ，保護細胞對抗A Confocalimmunofluorese

33、nce analysis ,Western blot and the MTT reduction assay, TGZ可使海馬神經元軸突直徑增加，促進神經末梢分化。使胞質-cat增加，存活能力加強。GW9662使存活能力下降。微管相關蛋白Fig. 6. Troglitazone increases cytosolic -catenin and neuroprotects against A-induced toxicity. Primary hippocampal neurons were teated with the antidiabeticthiazolidinedione drug,

34、troglitazone (TGZ) and analyzed for -catenin protein levels and cell viability against A-induced toxicity. (A) Confocalimmunofluoresence analysis of -catenin and MAP1B protein in 1 M TGZ treated neurons for 24 h. Note increased cytoplasmic -catenin levels and axonal caliber engrossment (arrow). (B)

35、TGZ activates Wnt/-catenin signaling and attenuates A-dependent neurotoxicity. Hippocampal neurons were incubated with 5 M A fibrils in the presence or absence of TGZ (10 M) or GW9662 (10 M). After 2 or 24 h, cytoplasmatic -catenin levels and cell viability were determined by Western blot and the MT

36、T reduction assay, respectively. Values represent the meanFS.E.M. in relation to control cells.3.乙酰膽堿受體激活劑:通過激活Wnt/-Catenin 途徑,起神經保護作用。AF267B (乙酰膽堿受體激活劑) GSK3 -Cat 促進細胞增殖PNZ-乙酰膽堿受體拮抗劑-GSK3 -CatAchE(acetylcholinesterase)促進A 形成（AchE在SP中與A 形成A AchE 復合物毒性大于 (A)。 膽堿酯酶(AchE)的抑制劑（tacrine）-抑制乙酰膽堿的分解，用于AD的治療

37、。AF267B (乙酰膽堿受體激活劑) GSK3 -Cat 促進增殖 PNZ-乙酰膽堿受體拮抗劑-GSK3 -Cat 促進凋亡Fig. 7.乙酰膽堿受體激活劑-AF267B 抑制GSK-3活性，增加胞質-Cat immunoprecipitates Western blot and the MTT reduction assay, AF267B- 乙酰膽堿受體激活劑PNZ-乙酰膽堿受體拮抗劑MTTWestern blotFig. 7. The GSK-3 activity increase associated to A-neurotoxicity and Wnt/h-catenin sign

38、aling inhibition is prevented by M1 mAChR activation in hippocampal neurons. (A) Cells were co-treated with 5 M Awith or without 10 M AF267B in the presence or absence of 10 nM PNZ. GSK-3h activity was measured in GSK-3h immunoprecipitates by scintillation counting and expressed as percentage in rel

39、ation to the control activity of untreated neurons. (*pb0.001; *pb0.005 Student t-test). (B) Hippocampal neurons were incubated with 5 M A fibrils, in the presence or absence of 10 M AF267B and 10 nM PNZ. After 2 or 24 h, cytoplasmatic h-catenin levels and cell viability were determined by Western b

40、lot and the MTT reduction assay, respectively. Values represent the mean FS.E.M. in relation to control cells. 泛素- 蛋白酶體系統 與NFT 泛素- 蛋白酶體系統（Ubiquitin-proteasome system,UPS）與NFT： 可高度選擇性的降解蛋白質，清除細胞內異常聚集和錯誤折疊的蛋白質。其與神經退性性疾病的發病有關。 1.蛋白酶體與tau的降解作用： Tau是蛋白酶體的底物。26S蛋白酶體通過泛素依賴型方式降解tau。細胞內正常tau以非折疊結構存在，可被蛋白酶體降解

41、。2.蛋白酶體功能異常和NFT： AD患者的蛋白酶體功能異常，是導致PHF形成NFT的原因。AD中蛋白酶體功能下降的原因： a.泛素突變體抑制蛋白酶體的活性； b.氧化應激引起蛋白酶體異常修飾；氧化應激引起蛋白質共價交聯，導致蛋白酶體不能清除異常蛋白質。 NFT由異常磷酸化的tau組成，異常磷酸化的tau在AD中聚集成PHF，進而形成NFT。 蛋白酶體功能下降導致異常蛋白質清除障礙，是形成NFT的原因。c. AD的tau蛋白質異常修飾增多，加重蛋白酶體的降解負擔，導致蛋白酶體不能有效地清除細胞內的異常蛋白質。 tau蛋白質異常修飾增多發揮重要作用。泛素(ubiquitin)76個氨基酸組成的多

42、肽(8.5kD) 普遍存在于真核生物而得名 一級結構高度保守包括三種酶參與的3步反應，并需消耗ATP。蛋白酶體(proteasome) 對泛素化蛋白質的降解Ubiquitination processE1：泛素激活酶E2：泛素結合酶E3：泛素蛋白連接酶(辨認指定蛋白)UBCO-O+HS-E1ATPAMP+PPiUBCOS E1HS-E2HS-E1UBCOS E2UBCOS E1UB：泛素Pr：被降解蛋白質PrHS-E2UBCOS E2UBCNH OE3PrE1-激活泛素分子；激活的泛素被轉移至E2的巰基上；E2將泛素固定在需要降解的蛋白質上E3具有辨認蛋白質的功能，將活化的泛素轉給要降解的蛋白質的氨基形成異肽鍵。泛素化的蛋白質在蛋白酶體降解。泛素介導的蛋白質降解過程： 早老素 與AD 早老素(presenilin, PS)有關，其突變和早老性癡呆遺傳類型有關 。PS是細胞細胞連接粘合連接成分8次跨膜蛋白, PS-1 PS-2的異常表達加劇細胞骨架造成的分泌缺陷，促進形成APP堆積，為AD的標志。PS分為PS-1和PS-