1、基因工程原理總復習提綱第一單元基因的基本概念和現代概念一、基因與基因工程概述基因工程誕生的理論基礎40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分 子載體是DNA,而不是蛋白質。50年代揭示了 DNA分子的雙螺旋結構模型和半 保守復制機理，從而解決了基因的自我復制及傳 遞；50年代末和60年代初相繼提出了“中心法則” 和操縱子學說并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡 明了遺傳信息的流向和表達問題。基因工程誕生的技術基礎DNA分子的切割與連接技術(核酸內切限制酶和 DNA連接酶的發現)；測序技術(DNA核酸序列的結構及分析技術)；克隆載體構建技術(質粒載體；噬菌體載體;柯 斯載體;單鏈噬菌體載體;噬菌粒載體

2、；遺傳轉化技術(大腸桿菌轉化體系)；瓊脂糖凝膠電泳技術；Southern雜交技術；基因的定義基因的數量二、基因的命名法通則細菌基因的命名法酵母基因的命名法線蟲基因的命名法果蠅基因的命名法植物基因的命名法脊椎動物基因的命名法人類基因的命名法三、基因的結構基因的組成部分編碼區(coding region);非編碼區(noncoding region);啟動區(promoter region);終止區 9terminator).原核基因定義原核基因的組成：啟動區序列區轉錄區序列區(5, 一 UTR; cDNA序列 區-編碼區；3, 一UTR); 終止序列區真核基因定義真核基因特征：真核基因編碼區中往

3、往含有非編碼序列的內含子(intron);真核基因是單順反子，編碼 單基因產物；成熟mRNA分子的5-，端有 一個帽的結構，3，-端有一段 poly(A)尾巴。真核基因的組成：啟動子序列區終止子序列區 轉錄序列區真核基因初級轉錄本的組成：5，-UTR序列區表達子(exon) 內含子(intron)3, -UTR序列區真核基因成熟mRNA的結構組成：5-端帽的結 構;5, -UTR;編碼序列區;3, -UTR;3,-端 poly(A)尾 巴。四、基因的類型根據拷貝數分類單拷貝基因多拷貝基因根據表達特性分類組成型基因(Constitutive gene)又叫看家基因 (Housekeeping g

4、ene)誘導型基因(Inducible gene)根據產物類型分類結構基因(Structural gene)調節基因(Regulator gene)根據實驗用途分類選擇基因(Selectable gene)標記基因(Marker gene)報告基因(Reporter gene)根據排列組合特性分類基因家族(Gene family)基因簇(Gene cluster)弧獨基因(Orphons)根據細胞類型分類原核基因(Prokaryotic gene)真核基因(Eukaryotic gene)根據結構特點分類斷裂基因(Split gene)移動基因(Movable gene)假基因(Pseudog

5、ene)根據序列重復特性分類重疊基因(O verlapping gene)嵌套基因(Nested gene)重復基因(Repeated gene)9.根據同源性分類d.程序基因擴增(Programmed gene同源基因(Honologouse gene)共生同源基因(Paralogous gene)amplipication)e.生物進化基因擴增直向同源基因(Orthologous gene)孤獨基因家族(Orphon family)10.根據堿基突變分類野生型基因(Wild type gene)突變型基因(Mutant type gene)五、基因圖與基因作圖1. 基因圖(gene map

6、)包括： a.遺傳圖(genetic map) 厘摩(centimorgan,cM)遺傳圖距或是染色體上基因間的距離 以摩爾根單位表示(morgan unit),摩爾 根單位等于100%的重組率(交換值)。八、基因表達正義鏈與反義鏈基因表達定義：基因通過DNA的轉錄和RNA的轉譯等過程，將其 遺傳信息轉變成蛋白質(RNA轉錄本)的過程，叫做 基因表達。基因表達產物有些基因如tRNA基因和rRNA基因最終表達產 物是RNA大部分基因的表達的最終產物是蛋白質基因表達的時空特異性基因表達活性的調控1厘摩(cM)則等于1%的重組率。人類基因組1cM相當于1000Kb擬南芥基因組1cM相當于290Kb蕃

7、茄基因組1cM相當于750Kb小麥基因組1cM相當于3500Kb物理圖(physical map)限制圖(restriction map)2.基因作圖(gene maping)六、DNA非編碼序列的功能1.中心法則質疑九、基因克隆與基因工程克隆的詞義基因克隆與DNA克隆基因克隆的方法互補作用基因克隆cDNA克隆基因組DNA克隆基因定位克隆基因克隆與基因分離第一單元DNA分子的體外切割與重組RNA的功能假基因的功能反義RNA的功能RNA的干擾作用微 RNA(micro RNA)的功能核糖開關表觀遺傳學遺傳印記(Genetic imprinting)遺傳印記與遺傳性疾病表觀遺傳信息層(Epigen

8、etic lager of information)生命有機體遺傳信息的第三層次， 它貯藏在圍繞DNA分子周圍并與DNA分子結 合的蛋白質及化學物質中，表觀遺傳信息層可 能比RNA甚基因更為重要。甲基化作用與遺傳印記甲基化藥物與癌癥治療七、基因擴增一、基因克隆涉及的一些重要的酶核酸酶(Nuclease)核酸外切酶核酸內切酶蛋白酶(Proteinase)基因工程中涉及的主要的酶2型核酸內切限制酶DNA 連接酶(Ligase)DNA聚合酶反轉錄酶(Reverse transcriptase)多核苷酸激酶(Polynucteotide kinase)末端轉移酶(Terminal transferas

9、e)核酸外切酶(Exonuclease)堿性磷酸酶(Alealine phosphatase)小牛腸堿性磷酸酶(CIP)細菌堿性磷酸酶(BAP)Tag DNA 聚合酶(Tag DNA polymerase)基因增加與基因減少基因擴增的五種情況：PCR基因擴增克隆基因擴增環境壓力基因擴增一、核酸內切限制酶與DNA分子的體外切割寄主控制的限制與修飾現象核酸內切限制酶及其類型：1型核酸內切限制酶2型核酸內切限制酶3型核酸內切限制酶2型核酸內切限制酶的特點識別序列粘性末端(Cohesive ends)平末端(Blunt ends 或 flush ends)平末端連接方法：T4 DNA連接酶連接法；同聚

10、物加尾法；銜接物(Linker )連接法；DNA接頭(Adapter)連接法。同裂酶與同尾酶同裂酶(Isoschizomers)具有同樣的識別位點，產生同樣的粘性末端， 但是從不同的細菌中分離出來的類核酸內切限 制酶。同尾酶(Isocaudamers)一組來源不同、識別序列各異，但能夠切割形 成相同的粘性末端的核酸內切限制酶。異裂酶(Neoschizomer)這是一組來源不同，但具有相同的識別序列和 不同的切點(cleave point)的核酸內切限制酶。影響核酸內切限制酶活性的因素三、DNA連接酶與DNA分子的體外連接DNA 連接酶(DNA ligase)簡稱連接酶，是指利用ATP分子中的r

11、-磷酸基團為 能量，催化在兩條并排DNA鏈的5,-磷酸基團和3, -羥基之間或是雙鏈DNA單鏈斷裂位置形成一個磷 酸二酯鍵，而使兩個DNA片段共價連接起來的一種 酶。DNA分子連接的條件：3 -端具有一個游離的羥基(-OH);另一條DNA鏈的5,-末端具有一個磷酸基團 (-P);連接反應需ATP的參加。影響DNA分子體外連接反應的因素：ATP濃度；連接酶濃度；反應時間；反應溫度；插入 片段與載體分子間的摩爾比值。第三單元：基因克隆的載體一、質粒載體質粒載體定義質粒DNA分子的構型及其在凝膠電泳申泳中的位置SC構型(雙鏈、共價、閉合的超盤旋DNA)-走在 凝膠最前面；OC構型(單鏈斷裂的開環DN

12、A)-走在凝膠最后 面；L構型(雙鏈斷裂呈線型DNA)-走在凝膠的中間 位置。質粒載體的組成：具有復制區或復制因子(replicator)具有1-2個抗菌素抗性基因；具有若干種限制酶的單一識別位點；具有較小的分子量和較高的拷貝數。質粒DNA的自我轉移質粒DNA的遷移作用(mobilization)遷移作用的分子機理質粒的拷貝數質粒的不親和性質粒DNA的復制與拷貝數的控制質粒復制控制的分子模型：抑制蛋白稀釋模型；自體阻遏蛋白質模型嚴緊型質粒與松馳型質粒質粒載體的類型：插入失活型載體表達型質粒載體；正選擇質粒載體 重要的質粒載體：pBR322質粒載體：pUC質粒載 體。二、噬菌體載體噬菌體的一般生

13、物學問題；烈性噬菌體與溫和噬菌體；混濁型噬菌斑和清亮型噬菌班；噬菌體的溶源化與溶源性細菌；噬菌體的整合作用與原噬菌體；超感染免疫入噬菌體載體cos位點(粘性末端位點)入噬菌體載體構建原理；插入型入噬菌體載體與替換型入噬菌體載體；具有內刪除作用的入噬菌體載體；入ZAP載體的結構：含有一個發生內刪除作用的pBluescript噬菌粒 的DNA區段；在pBluescript的兩側含有f的起始子(I)和終止 子(T)；在pBluescript的內部具有LacZ基因；在LacZ基因內部具有兩端分別為T3和T7噬 菌體啟動子和多克隆位點區(MCS);內刪除作用的原理入重組體DNA分子的體外包裝體外包裝原理

14、包裝限制入噬菌體載體的克隆能力(23Kb理論值)三、柯斯質粒載體柯斯質粒載體的定義柯斯質粒載體的組成部分：質粒的復制起點；帶有1-2個抗菌素抗性基因；來自入噬菌體DNA的cos位點；來自質粒的相當數量的核酸內切限制酶單一識 別位點柯斯質粒載體的特點：來自入噬菌體的特點，體外包裝后可高效轉導感 受態細胞，導入細胞后可重新環化，無法進入溶 菌周期，因此無法形成子代噬菌體。具有質粒載體的特點，帶有質粒復制子，可像質 粒一樣復制，在有氯霉素下擴增；具有抗生素抗 性基因，因此可像質粒載體一樣篩選重組體。具有高容量的克隆能力(31-45Kb)四、單鏈噬菌體載體M13單鏈噬菌體的一般生物學特性 M13克隆體

15、系列組成：a. M13克隆載體；b. M13的寄主菌株X-gal顯色反應原理順反子內互補作用(a-互補作用)M13載體系列的優點：制備單鏈DNA序列重組子可用組織化學檢測LacZ基因上有一段多克隆位點序列區(MCS)可定向克隆五、噬菌體展示載體構建噬菌體展示載體的原理絲狀噬菌體展示載體噬菌體表面展示文庫六、噬菌粒載體噬菌粒載體的定義噬菌粒載體的組成：來自質粒部分：a.來自ColE 1的復制起點(ori);b.抗菌素抗性標記；來自噬菌體部分：a. f!單鏈噬菌體的復制起點(ori);與形態發生有關的DNA序列。噬菌粒載體的優點：a.可像質粒一樣復制，產生雙鏈 DNA;復制方向可改變，形成單鏈DN

16、A，不必亞克隆，可直接用于測 序；可產生大片段的外源單鏈DNA。pBluescript 噬菌粒體外轉錄載體定義；pBluescript 結構特點c. pBluescript噬菌粒載體的組成：*a.具ColE1質粒的復制起點(ori)，可產生雙 鏈 DNA;*b.具Ampr抗性基因，提供轉化子篩選；*c.具pUC19的多克隆位點(MCS)，克隆外源 基因；*d.在MCS兩端具有T3和T7啟動子，指導 外源基因錄*e.具LacZ基因，可組織化學選擇重組子；*f.具M13單鏈噬菌體的復制起點，可產生單 鏈DNA亞克隆可進行測 序第四單元基因克隆與基因分離、基因克隆基因克隆的概念基因克隆與DNA克隆基

17、因克隆的基本過程基因文庫的類型(基因組文庫與cDNA文庫)基因克隆與分離的實驗策略物理策略生物學策略克隆樣品的選擇：從蛋白質出發；從mRNA出發；從DNA大分子出發。基因文庫庫容測算cDNA基因克隆概述cDNA文庫的構建：第一步：分離細胞總RNA，根據poly(A)尾巴用 oliga(dT)柱分離純化出mRNA;第二步：用適當的引物，通常用oliga(dT)和反轉 錄酶合成第一鏈 cDNA；第三步：雙鏈cDNA的獲得:用RNaseH酶降解 mRNA-cDNA分子中的mRNA鏈,再用第 一鏈為模板合成第二鏈cDNA。第四步：與適當載體重組，將重組體分子導入大 腸桿菌寄主細胞增殖，即構成cDNA文

18、 庫。cDNA克隆的優越性：*a.以mRNA出發，對一些在增殖過程中 不經過DNA中間過程的RNA病毒， 特別適用；*b.從mRNA出發，其復雜度要比蛋白質 低 10-100 倍；*c.假陽性比例低。每一個克隆都含有一個mRNA;*d.具有特殊用途：克隆的真核基因在原核 細胞中表達；*e.測定基因核苷酸序列;發育調節基因表 達特性分析，即時空特異性。d.全長cDNA的合成基因組DNA克隆cDNA克隆的局限性基因組DNA克隆的過程：*a.分離基因組DNA;*b.體外切割片段化(超聲波處理;機械切割；限 制酶局部消化)與適當載體重組；*c.轉化大腸桿菌細胞增殖即構成基因組文庫。基因組文庫的優越性：

19、*a.基因類型的全面性，一個完整的基因組文 庫中，該生物有機體的基因都有一個克隆；*b.基因結構的完整性，包括啟動子、表達子、 間隔子、終止子等所有結構；*c.基因的恒定性，即不受材料組織部位和發育 階的影響；*d.基因的功能性，適于研究基因的表達與調控。基因的定位克隆(用于分離編碼產物未知基因的方法 之一)定位克隆的程序和條件分子標記RFLP在定位克隆中的應用RFLP作圖過程染色體步移大尺度物理圖譜的構建目的基因的分離分離克隆基因的若干方法：應用核酸探針分離克隆的目的基因應用差別雜交法和扣除雜交法分離克隆的基因PCR技術.mRNA差別顯示技術(產物未知基因分離方法)表達文庫技術酵母雙雜交體系

20、(Y2H，產物末未知基因分離方 法)定位克隆分離產物未知基因DNA標簽法分離產物末未知基因應用DNA芯片技術應用mRNA差別顯示技術分離產物末未知基因mRNA差別顯示的原理：基本原理是，以多細胞(或但組織)的總RNA反 轉錄成的cDNA群體為模板，通過合理設計的 5,端與3,端引物的配對組合，將細胞(或組織) 中表達的約15%的基因片段擴增，直接顯示在 DNA測序膠上，從而找出一對細胞或組織中表 達有差異的cDNA片段。*a.高等真核生物的mRNA3，端大多具有 poly(A)尾巴,故可用oligo(dT)作引物，反 轉錄成cDNA;*b.根據mRNA poly(A)前2個堿基可把所有 的mR

21、NA分成12類群，如按一個堿基可 歸為3大類群,3,端作錨定引物也就為3 大類群；*c.根據數理統計，5端的隨機引物需80種， 因此80 x3=240組合對;就有可能分離到 目的基因。基因差異表達(differential expression)：在生物個體發 育的不同階段，或在不同組織或細胞中 發生的，不同基因按時間、空間進行有 序表達的方式，叫做基因差異表達。k. mRNA差別顯示技術的優點和缺點應用DNA標簽法分離產物未知的基因原理：DNA標簽法(DNA tagging)，是根據DNA的插 入作用發展出來的。其原理：當一段己知的特定DNA序列插入到基因組中目 的基因的內部、或附近，便會誘

22、發該基因發生突 變，并最終導致表型變化，形成突變體(突變株)以特定的己知序列為DNA雜交的分子探針，從 突變株的基因組DNA文庫中篩選到突變的基 因。利用標簽序列以外的突變基因序列為探針，再從 野生型基因組DNA文庫中克隆出野生型的目的 基因。類型：轉位子標簽法：可分為一元轉位子標簽法 (One-element tagging systebm)二元轉位子標 簽法(Two-element tagging system)T-DNA標簽法酵母雙雜交體系(Y2H)分離產物未知的基因轉錄因子定義轉錄因子的結構：(a) DNA結構域(DNA-BD)轉錄調節域：(轉錄激活域 (AD);轉錄抑制域)核定位信號

23、區寡聚化位點酵母半乳糖苷酶基因的轉錄因子-GAL4E.coli-Yeast穿梭質粒(定義)穿梭質粒(Shuttle vetor):是一類人工構建的具 有兩種不同的復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞中進行復制和存 留的質粒載體。這種質粒載體可以攜帶外源DNA在原核細胞和真核細胞往返穿梭。j.酵母雙雜交體系構建兩種穿梭質粒載體DNA-BD質粒載體(具有色氨酸編碼基因 Trp)產生第一種雜種蛋白AD質粒載體(具有亮氨酸編碼基因Leu) 產生第二種雜種蛋白酵母雙雜交體系的寄主菌株特點：*a.喪失了表達內源GAL4轉錄因子的 能力；*b.具有LacZ報告基因；*c. trpl和ler2轉化標記，

24、在缺少色氨 酸和亮氨酸的培養基中無法生長。酵母單雜交體系(Y1H)原理：酵母單雜交體系是一種體內分析系統，用 于分離與順式作用調控元件結合的特定蛋白質之 編碼基因。許多真核轉錄因子都是結構上可以分開、功能上 相互獨立的兩個結構域組成。用一種未知蛋白質代替BD和AD形成融合蛋白 質，如果此未知蛋白質能夠與調控序列結合，它 就可以攜帶AD靠近起始復合物，從而起動基因 轉錄。通過篩選cDNA-AD表達文庫，可以分離 與鑒定新的DNA結合蛋白質。酵母三雜交體系(Y3H)第五單元新基因的功能鑒定一、新基因功能鑒定的技術轉基因技術與基因過表達技術：a.轉正義基因(目的 基因)轉基因(目的基因)的過表達。基

25、因剔除技術(基因打靶)RNA干擾技術與新基因功能鑒定基因序列同源比對技術，驗證新基因的功能蛋白質產物的結構與功能的檢測基因定點突變途徑探索新基因的功能報告基因技術反義RNA技化學遺傳學方法；遺傳互補法基因表達系列分析法噬菌體表面展示技術與酵母雙雜交技術二、同源性分析與基因功能鑒定序列同源性與相似性、一致性及保守性概念基因序列同源性比對技術原理a. DNA分子的核苷酸序列或是蛋白質多肽鏈的氨 基酸序列，具有高度相似性或顯著相似性的基因 或蛋白質，往往是同源的。親緣關系密切的或相關的基因，具有相似的(或 相近的)核苷酸序列結構，可以通過機算機的檢 索已經測序并己知其生物學功能的其它物種的 相關基因

26、(同源基因)并根據核苷酸序列比對分 析所得出的相似性程度，推斷待鑒定的新基因之 可能的生物學功能。同源基因的類型：直向同源因(Orthologousgene)共生同源基因(Paralogous gene)三、基因失活與新基因功能鑒定同源重組與基因失活同源重組(Homologous recombination)：是指兩 條同源DNA序列之間發生的遺傳信息的重組或 交換的過程。.主要技術：*a.醇酵母缺失盒技術；*b. 基因剔除技術酵母缺失盒技術與新基因功能鑒定，其核心是使 用一種特殊的分子結構即酵母缺失盒，通過同源 重組途徑，使待鑒定中的目的基因失活。酵母缺失盒的分子結構：*a.中央部分是一種抗

27、菌素抗性基因的編碼序 列；*b.在此基因的兩側各有一個核酸內切限酶的 識別位點(R1和R2);*c.在缺失盒的5,端，位于限制位點R1和抗菌 素抗性基因之間，還有一個酵母啟動子。2基因剔除(基因打靶)與新基因功能鑒定基因剔除技術主要應用于哺乳動物，其原理也是 利用同源重組使基因失活。基因打靶(Gene targeting)定義：使外源基因定 點地整合到核基因組上的一種特殊的基因工程 技術。也叫做基因定點重組或基因剔除基因打靶的分子基礎：通過轉染的細胞中發生的 外源打靶基因與核基因組上的目標基因之間的 DNA同源重組事件，使外源打靶基因定點地整 合到核基因組的特定位置上，從而達到改變細胞 遺傳特

28、性的目的。基因打靶的類型：(a)插入型基因打靶；(b)取代型基因打靶基因打靶載體(Gene targetion vector)基因打靶的過程基因打靶的應用：(a)新基因功能鑒定；提高基因表達效率；遣遺傳疾病的基因治療四、轉譯抑制與新基因功能鑒定1. RNA 干擾(RNA interference, RNAi)概念：近年來研究表明，一些小分子量的外源雙鏈RNA(dsRNA)當其導入寄主細胞之后，便可促進 與其同源的內源mRNA發生特異性的降解作 用，從而高效特異地阻斷體內相應基因的表達活 性，在細胞內發生奠基因剔除作用。這種RNA水平的基因抑制，是生物界普遍存在 的RNA水平調控基因表達的一種方

29、式，提供了 一種特異性失活功能基因的方法。研究表明，RNAi廣泛存在于真菌、擬南芥、水 螅、斑馬魚等大多數真核生物中，是生物體內抵 御外耒來感染們的重要保護機理。RNAi的應用：新基因的功能鑒定;有望在疾病防 御和治療的新藥開發上發揮重要的作用。有關的名詞術語和略語dsRNA:雙鏈 RNA(double stranded RNA)siRNA:小分子量干擾 RNA (small interference RNA)RISC: RNA誘導的沉默復合物(RNA inducedsilencion complrx)RdRP : 依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA-dependent RNA po

30、lymerase)PIGS :轉錄后基因沉默(Post-transcripotional gene silencing)TIGS:轉基因誘導的基因沉默(Transgene-induced gene silencing)VIGS:病毒誘導的基因沉默(Virus-induced gene silencing)Dicer:切丁酶，是一種RNase111樣的核酸內切酶 (Rnase111-Like)。能把 dsRNA 切割成 21-25bp的小分子量的干擾RNA,即 siRNA， 但這是需要能量ATP的過程。RNAi的分子機理研究依賴于RdRP的RNAI途徑不依賴于RdRP的RNAi途徑關于Dicer

31、和Slicer酶功能的作用機理RNAi 的觸發劑(Triggers of RNA silencing)siRNA的來源：由人工導入細胞的dsRNA經Dicer酶切割成的 siRNA由浸染的RNA病毒復制的dsRNA經Dicer酶切 割成的siRNA由脂質體運點的siRNA由小分子RNA前體(MicroRNAprecusor)等產生 的dsRNA經Dicer酶切割由psiRNA載體持續合成的siRNApsiRNA克隆載體RNAi的新基因功能鑒定的優越性*a.效率高，無需篩選突變體因此工作量小；*b.具有靶向性，根據psiRNA載體插入序列的 方向斷定被失活的目的基因的功能；*C.具有多重失活功能

32、，既可特異地使某一特 定基因沉默，也可同時使該基因家族的多個 成員沉默；*d. RNAi技術不會導致致死效應，便于研究植 物生長發育的相關基因的表達活性與功能。五、基因表達系列分析與新基因功能鑒定基因的差異表達(Differntial expression of gene)看家基因(House-keeping gene)發育調節基因(Developmental regulatedgene)基因的差異表達基因表達系列分析法的定義基因表達系列分析法(Serial analysis of gene expression),簡稱SAGE，它是一種基于2型核酸內 切限制酶和3型核酸內切限制酶，對于cDN

33、A分子 聯合切割反應的基因表達分析法。此法可快速、有 效、系統、全面地檢測某種特定組織或細胞中基因 表達的狀況，適于對大量基因的差異表達狀況進行 系統的分析。SAGE技術是使用惟一的序列標簽去鑒定每一種 mRNA分子。可同時檢測許多種基因在同一時空條 件下是否表達及其表達水平，而還可比較不同組織 不同條件下，基因表達的差異。原理基因表達系列分析法的基本原理是，cDNA分子中 同一種核酸內切限制酶位點旁側的9個核苷酸序列， 可以代表一種cDNA分子的序列結構特征。根據這 種長度為9bp的核苷酸序列，能夠區分基因組中的 95%的基因。(49=262144種mRNA分子)所以這一 段序列可以作為特定基因的標簽，特稱之為SAGE 標簽。應用特定的技術程序，能夠制備某一組