1、HLA基因分型和抗HLA抗體檢測在異基因造血干細胞移植中的臨床意義HLA基因的分子結構及特征HLA基因分型在allo-HSCT中的臨床應用抗HLA抗體檢測的臨床意義美國ASHI認證實驗室的價值Part HLA基因的分子結構及特征 HLA(人類白細胞抗原)基因的結構HLA位于人類6號染色體,存在于人體的各種有核細胞表面HLA的命名與分辨率的相關性HLA-A*02:101:01:02N基因血清型低分辨 02:XXSSP或SSOP基因型中分辨 02:ZAHD-SSOP蛋白相同,編碼區無義突變非編碼區,內含子不表達蛋白特異蛋白高分辨 02:01G等位基因 02:01SBT+GSSPSBT實驗方法學分辨

2、率HLA基因分型實驗方法的發展血清學方法特異性引物PCR擴增法(SSP)正或反向寡核苷酸探針雜交法(SSOP)-Luminex技術核苷酸序列分析法(SBT)-一代基因測序技術單分子核苷酸序列分析法(NGS)-二代基因測序技術HLA基因分型分辨率在HSCT中的應用HLA低分辨基因分型:臍血庫入庫供者,器官移植HLA中分辨基因分型:家系單倍型完整的親緣HLA全相合移植,臍血移植(根據Code碼和常見等位基因頻率組合排除),器官移植HLA高分辨基因分型:無關供者入庫,親緣移植(包括家系單倍型不完整的HLA全相合和單倍體),臍血移植HLA等位基因分型:非血緣移植,包括HLA全相合和部分等位基因錯配無關

3、供者移植Part HLA基因分型在allo-HSCT中的臨床應用日本學者對AML,CML和MDS標危患者進行HLA-1個抗原錯配親緣供者與HLA-8/8相合無關供者比較研究提示,移植后總死亡率升高; HLA-B抗原錯配移植后TRM升高,OS下降;C抗原錯配或多個等位基因錯配在B抗原錯配中出現頻率高且與移植預后差相關.美國研究表明:無關供者全相合的移植效果明顯好于1個等位基因或1個抗原錯配的親緣錯配供者.結論:優先選擇無關全相合供者進行HSCT無關HLA全相合與親緣1個抗原錯配HSCT的預后比較HLA基因分型在選擇無關供者錯配HSCT中的建議NMDP數據顯示:HLA-A,B,C,DR位點全相合和

4、1個位點錯配GvHD發生率28%VS 37%;1年OS 52%VS 43%. B,C位點錯配的耐受好于A, DR位點. (BM-URD)NMDP推薦選擇策略HLA-A,B,C等位基因錯配好于抗原錯配,最不利因素是C抗原錯配; A,DQ等位基因和抗原與DR抗原錯配均不影響移植后復發和cGvHD;DP選擇可允許等位基因錯配;推薦選擇免疫原性低和可允許的錯配位點.(PSC-URD)如果供受者A,B,C,DR位點不全相合,應該增加檢測DQ, DP和 DR3/4/5位點的基因分型,以便選擇最合適的供者進行移植. HLA基因分型在無關臍血供者選擇中的作用NMDP基本原則:有核細胞數量(2.5107/kg和

5、HLA4/6 匹配度(HLA-A/B抗原相合, DR等位基因相合);建議選擇HLA-5/6以上相合臍血強烈推薦C位點分型,以及所有位點進行高分辨分型,可以明確等位基因錯配類型對移植預后的影響強烈推薦檢測抗HLA抗體;選擇非遺傳母系HLA抗原(NIMA)相合的臍血NMDP/CIBMTR最新研究表明: HLA-C和DR位點錯配是移植相關死亡的高危因素目前還沒有雙份臍血與受著之間的匹配原則,但實踐證明2份臍血最佳達到HLA-A/B抗原和DR等位基因相合,最低為4/6相合 HLA基因分型在單倍體移植供體選擇中的意義在非清髓的惡性血液病單倍體移植中HLA-和錯配程度的增加并沒有明顯影響cGvHD和NRM

6、的累積發生;存在HLA-DR抗原錯配和與2個HLA-A,B,C等位基因錯配與低的累積復發率和改善的EFS密切相關,DQ抗原錯配無此影響KIR基因分型的價值:在未去T細胞的AML移植中供者為B/x單倍型的OS顯著高于A/A.因此, KIR基因分型應該加入到供者選擇的標準中,未來應用KIR-B單倍體的亞型分類可更精確的選擇供者抗HLA抗體檢測:如為抗供者的特異性抗體應進行相應處理后再接受移植北大人民醫院推薦單倍體移植供者選擇考慮因素:子女首選，父親好于母親，同胞兄長、年齡、 NIMA相合Clinical outcomes of allo-HSCT from matched or mismatche

7、d URDAML (n=359)ALL (n=275)CML (n=200)P vlaueOS62.5% (226/359)53.5% (150/275)79.2% (158/200)0.003HLA match68.6% (103/150)61.1% (71/117)81.2% ( 67/82)0.098HLA mismatch58.8% (123/209)50.3% (79/158)77.5% (91/118)0.035Relapse9.7% (35/359)10.5% (29/275)2.0% (4/200)HLA match11.3% (17/150)11.1% (13/117)1.2

8、% (1/82)HLA mismatch8.6% (18/209)10.1% (16/158)2.5% (3/118)P value0.390.790.51TRM16.2% (58/359)25.8% (71/275)17.5% (35/200)HLA match13.3% (20/150)23.9% (28/117)14.6% (12/82)HLA mismatch18.2% (38/209)27.2% (43/158)19.5% (23/118)P value0.220.540.37aGVHD46.2% (166/359)47.6% (131/275)49.0% (98/200)HLA m

9、atch42.0% (63/150)40.2% (47/117)41.5% (34/82)HLA mismatch49.3% (103/209)53.2% (84/158)54.2% (64/118)P value0.170.030.08根據2010年中華骨髓庫隨訪數據總結可允許和不允許HLA高分辨等位基因和抗原錯配類型 中華骨髓庫非血緣HSCT的3年隨訪數據總結各種白血病接受等位基因或抗原錯配無關供者allo-HSCT后1年和2年OS,以及aGVHD,cGVHD存在差異,因此,需要根據疾病分型選擇可允許錯配類型在AML,ALL中C*07:02與C*03:04抗原錯配;在ALL,CML中涉及各

10、種A*02:07等位基因錯配,DR等位基因加DQ抗原錯配;在ALL中2個等位基因錯配,B*15:XX等位基因加Cw抗原錯配;在AML,ALL中A*02:01與A*02:06等位基因錯配;以及在所有白血病中涉及B*39:XX等位基因的錯配類型,是目前CMDP隨訪數據中可考慮為不允許錯配類型,并影響移植的預后Part 抗HLA抗體檢測的臨床意義NMDP在臍血或錯配無關供者HSCT中需要檢測HLA抗體抗體陰性組,NDSA組,DSA組的粒系重建率分別是83%, 73%, 32%(P0.0001)抗體陰性組,NDSA組,DSA組的血小板重建率分別是72%, 60%, 33%(P=0.0036)抗體陰性組

11、,NDSA組,DSA組的2年EFS分別是43%, 29%, 15%(P=0.0001)抗體陰性組,NDSA組,DSA組的2年OS分別是57%, 50%, 31%(P=0.030) Takanashi et al. The impact of anti-HLA antibodies on unrelated cord blood transplantations. Blood, 2010,116 :2839-2846預存HLA抗體對單份臍血移植后造血重建的影響移植前預存抗MICA抗體延緩臍血移植后患者巨核系重建時間移植前預存抗HLA抗體,特別是HLA-類抗體導致臍血移植后患者aGVHD發生率升高

12、移植前預存抗HLA抗體患者的生存率降低 Ansari et al. The clinical relevance of pre-Formed anti-HLA and antiMICA antibodies after cord bood transplantation in Children. PLoS ONE. 2013;8(8):e72141.預存HLA抗體對兒童臍血移植預后的影響抗HLA抗體檢測在兒童移植再障移植中的意義移植前預存HLA抗體是判斷HSCT預后的獨立危險因素移植前預存HLA-類抗體影響HSCT的長期生存率,而HLA-類抗體與抗體陰性相比無差異移植前預存低滴度HLA-類抗體

13、,特別是HLA-A和C抗體影響HSCT的生存率在MUD-HSCT的惡性血液病患者,36.5%患者預存抗HLA抗體, HLA -I類,類,I和類均陽性患者比例分別為13.%,4.3%,19.1%預存抗HLA抗體陽性組中女性患者比例為57.1%,高于陰性組(27.4%), 差異具有統計學意義.移植后血小板重建時間預存抗HLA抗體陽性組和陰性組患者分別為平均13天(7-43)和14天(11-35),差異具有統計學意義.-度aGVHD的發生率在抗HLA陽性組和陰性組之間的差異有統計學意義(40.0% VS 22.2%, P=0.023).2年總生存率(OS)預存抗HLA抗體陽性組患者低于陰性組患者(6

14、6.6% VS 83.6%, P=0.04),差異有統計學意義;但是2年無病生存率(DFS)的差異無統計學意義(82.5% VS 93.1%, P=0.085);移植后復發率,移植相關并發癥發生率無差異. 預存抗HLA抗體在成人無關供者全相合HSCT中的意義患者張XX，女性，10歲，漢族，學生患者于2014年02月22無明顯誘因發熱，體溫最高39度，伴咽痛，無咳嗽咳痰，伴全身散在性出血點，血常規：白細胞 2.2109/L，血紅蛋白64g/L，血小板2109/L。形態學：骨髓有核細胞增生減低，全片未見巨核細胞，血小板少見；AA免疫分型提示CD3+CD8+達30.6%；自身抗體檢測：粒系CD15，

15、73.5%陽性，干系CD34，50.0%陽性，紅系陽性 15.1%；CMV和EBV的DNA檢測均為陰性。患者明確診斷為急性重型再生障礙性貧血I型（SAA-I型）。入院后予以輸注血小板，G-CSF、TPO等刺激造血及對癥支持后血象改善不明顯。患者有異基因造血干細胞移植適應癥，但無同胞供體，家屬選擇行雙份臍血造血干細胞移植。病例分析-本院移植中心HLA高分辨基因分型雙份臍血低分辨相合，高分辨結果分析是與父親一條單倍型相同患者2014-3-17開始FC+ATG方案預處理,GVHD預防采用CsA+短程MTX方案;患者移植前檢測抗HLA-I類抗體陽性(MFI值 537-2678),移植前-3天開始予大劑

16、量靜脈丙球(0.4g/kg3d)輸注-阻斷抗體介導的淋巴毒反應;03-26回輸雙份臍血(血型相同): 第一份有核細胞數 12.01108, CD34+細胞數 21.64105;第二份:有核細胞數 8.54108，CD34+細胞數 6.83105,細胞活力 87.2%。移植后造血重建延緩,+26天粒系重建,血小板持續低于20109/L,未脫離輸注;+29天復查骨穿:骨髓增生活躍,粒系占29.5%,紅系占62.5%,全片未見巨核細胞;PB-STR 95.9%;移植后+21天檢測HLA-類抗體仍陽性(MFI值551-1460);+30天予美羅華200mg治療一次,+36天血小板回升至97109/L;

17、移植后2個月復查抗體轉變為陰性動態檢測抗HLA抗體的結果分析檢測時間 抗體類型 抗體的MFI值治療2014-3-3移植前HLA-I類抗體陽性 其中A2抗體陽性 3047靜脈丙球2014-4-16移植后20天HLA-I類抗體陽性 新增B48,B37,B27,B7,B41, B47,B57,B61,A3,A22780,2314;1194-1813美羅華2014-4-30移植后34天HLA-I類抗體可疑陽性572,3392014-5-14移植后60天抗體轉變為陰性抗體清除常用的治療措施移植前預存抗HLA抗體是影響造血干細胞植入和造血重建時間延緩及存活最重要因素之一；對移植前預存HLA抗體陽性患者，可

18、采取相應的預處理治療措施：抑制或清除B細胞或漿細胞，如利妥昔單抗、硼替佐米；清除循壞抗體，如血漿置換、免疫吸附、供者來源的新鮮血小板輸注；阻斷已生成抗體介導的淋巴毒反應，如靜脈注射免疫球蛋白；抑制T/B細胞作用，如抗胸腺細胞球蛋白、抗淋巴細胞抗體等在allo-HSCT中遴選供受者的推薦流程病人: HLA-A,B,C,DRB1,DQB1高分辨基因分型供體親緣供者非親緣供者中華骨髓庫臍帶血庫HLA中分辨相合供者HLA-A,B,C,DRB1,DQB1高分辨確認分型HLA高/低分辨相合HLA低分辨4/6相合單倍型相同篩選供者: HLA中分辨基因分型檢索供者針對各種白血病分型進行供受者HLA等位基因錯配

19、分析, 增加檢測受者HLA抗體和供受者的KIR基因分型URD:HLA-8,9/10MM;RD:HLA-5/10以上MM選擇可允許HLA錯配位點,DSA陰性,KIR-B/x分型等因素首選親緣或無關全相合供者移植最快選擇到最佳供者選擇最合適的錯配供者綜合判斷Part HLA配型實驗室為何進行ASHI認證ASHI(美國組織相容性和免疫遺傳學會)是世界范圍內該領域權威認證機構,按照國際標準從事臨床移植相關領域的實驗室必須取得相關領域的認證資質ASHI認證委員會組織全世界該領域的專家制定了一套完善的質量控制標準是幫助實驗室減少發生差錯的幾率和提高HLA基因分型的質量,并且每年都對該標準進行更新實驗室在進行ASHI認證的過程中本身就是一個不斷學習和提高的過程,對于實驗室的進步和發展起決