1、茶樹(shù)bZIP轉(zhuǎn)錄(zhun l)因子基因CsbZIP1的克隆與表達(dá)(biod)定位 曹紅利 岳 川 周艷華 王 璐 郝心愿(xnyun) 楊亞軍* 王新超中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 國(guó)家茶樹(shù)改良中心 / 農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江杭州310008 * 摘 要：堿性亮氨酸拉鏈蛋白(bZIP)作為真核生物中分布最廣、最保守的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與多種生物學(xué)過(guò)程，尤其在植物抵御各種逆境脅迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技術(shù)克隆到茶樹(shù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為CsbZIP1(GenBank登錄號(hào)為JX050148.1)。該基因cDNA全長(zhǎng)1515 bp，包含

2、813 bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼270個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量29.484 kD；含有bZIP家族典型的BRLZ結(jié)構(gòu)域堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈，屬于B-關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；bZIP轉(zhuǎn)錄因子；CsbZIP1；亞細(xì)胞定位；克隆表達(dá) zip1家族；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示CsbZIP1屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子F亞家族；亞細(xì)胞定位結(jié)果表明CsbZIP1主要定位于細(xì)胞核；qRT-PCR分析表明，4低溫和NaCl鹽脅迫處理均能誘導(dǎo)CsbZIP1的表達(dá)，表達(dá)量變化趨勢(shì)都是隨著脅迫時(shí)間先逐漸升高，到24 h時(shí)降低，ABA脅迫處理24 h抑制CsbZIP1的表達(dá)。推測(cè)CsbZIP1與茶樹(shù)低溫、鹽等逆境脅迫密切相關(guān)。 Mo

3、lecular Cloning and Expression of a bZIP Transcription Factor Gene CsbZIP1 in Tea Plant (Camellia sinensis) CAO Hong-Li, YUE Chuan, ZHOU Yan-Hua, WANG Lu, HAO Xin-Yuan, YANG Ya-Jun*, and WANG Xin-ChaoTea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improveme

4、nt / Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China* Abstract: The basic leucine zipper proteins (bZIP) are one of the most extensive and conserved transcriptional factors families in eukaryotes, and plant bZIPs play important roles in many b

5、iological processes, especialy for resisting abiotic stresses. In this study, a bZIP full-length cDNA sequence was cloned using RACE and reverse transcription-PCR(RT-PCR) techniques from tea plant (Camellia sinensis). The obtained full-length cDNA was named CsbZIP1 with GenBank accession number JX05

6、0148.1. It is 1515 bp in length, containing a 813 bp open reading frame (ORF), encoding 270 amino acid residues with 29.484 kD molecular weight, and containing a typical BRLZ motif (basic region domain and leucine zipper domain) of B-zip1 family. The phylogenetic tree analysis revealed that CsbZIP1

7、belongs to F subfamily of bZIP. The subcellular location showed that CsbZIP1 protein is located in nucleus. The qRT-PCR analysis indicated that the expression level of CsbZIP1 was up-regulated by cold (4) and salt (NaCl) treatments, and both expression amounts increased at first, then declined after

8、 24 hours. However, the expression pattern was down-regulated by ABA treatment within 24 hours. These results demonstrated that CsbZIP1 could be associated with cold and salt stresses in tea plant. Keywords: Tea plant (Camellia sinensis); bZIP transcription factor; CsbZIP1; Subcellular localization;

9、 Cloning and Expression 茶樹(shù)(Camellia sinensis)原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶，是一種喜溫畏寒的經(jīng)濟(jì)作物。茶樹(shù)生長(zhǎng)和茶葉生產(chǎn)受低溫、干旱等環(huán)境條件的制約，發(fā)掘茶樹(shù)抗性基因，培育抗性較強(qiáng)的茶樹(shù)品種有重大意義。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TFs)在植物響應(yīng)逆境脅迫中具有重要的作用。它能夠激活或者抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，使植物適應(yīng)或抵御外界環(huán)境的變化。近年來(lái)，AP2/EREBP、MYB、NAC、WRKY和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境響應(yīng)中被廣泛研究1。其中，bZIP是真核生物中分布最廣、最保守的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子2bZIP轉(zhuǎn)錄因子(basic regi

10、on/leucine zipper proetin)，由一個(gè)與DNA結(jié)合的堿性結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈二聚體組成，是轉(zhuǎn)錄因子中最大家族之一，與植物抵御多種逆境脅迫密切相關(guān)，但在茶樹(shù)上還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。因此，克隆茶樹(shù)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因，分析其不同逆境脅迫下的表達(dá)特性，為茶樹(shù)抗性機(jī)制研究與抗性育種提供理論基礎(chǔ)有重要意義。 2 本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170650), 浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(Z3100473), 浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大專項(xiàng)(2012C2905-3)和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-23)資助。 。植物bZIP蛋白主要專一結(jié)合核心序列為ACGT回文結(jié)構(gòu)的

11、順式作用元件，如A-box (TACGTA)、* 通訊作者(Corresponding authors): 王新超, E-mail: xcw75, Tel: 楊亞軍, E-mail: yjyang, Tel:第一作者聯(lián)系方式: E-mail: caohongli, Tel:Received(收稿日期): 2014-01-08; Accepted(接受日期): 2014-04-16; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2014-05-16. URL: /kcms/detail/11.1809

12、.S.20140516.1002.019.html 2 C-box (GACGTC)和G-box (CACGTG)等元件3。目前(mqin)已經(jīng)在擬南芥4、水稻5和豆科植物6等基因組中發(fā)現(xiàn)(fxin)大量的bZIP家族基因。它們參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括光信號(hào)傳導(dǎo)、花的發(fā)育、種子成熟、病菌防御以及各種( zhn)非生物脅迫的響應(yīng)等4,7-10。近年來(lái)，已從玉米11、番茄12、高粱13、胡椒14、苧麻15等植物中克隆到逆境相關(guān)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，并證實(shí)它們與植物抗性密切相關(guān)。Wang等16在煙草中過(guò)表達(dá)剛毛檉柳(Tamarix hispida) ThbZIP1，能顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。Che

13、n等17在水稻中克隆到一個(gè)OsbZIP16，進(jìn)一步研究顯示OsbZIP16能正調(diào)控水稻抗旱性，并且轉(zhuǎn)基因水稻的抗寒性顯著增強(qiáng)。Liao等8前期，本課題組進(jìn)行了茶樹(shù)冷馴化轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從中獲得了一批受低溫誘導(dǎo)差異表達(dá)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的EST片段在擬南芥中過(guò)表達(dá)水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因GmbZIP44、GmbZIP46、GmbZIP62和GmbZIP78，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗寒性都得到提高。 181 材料與方法 。本研究通過(guò)RACE技術(shù)，克隆茶樹(shù)bZIP基因的cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和亞細(xì)胞定位，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在低溫、ABA和高鹽脅迫處理下的表達(dá)模式，探究bZI

14、P轉(zhuǎn)錄因子與茶樹(shù)抗逆性的關(guān)系，為茶樹(shù)抗逆基因工程提供候選基因資源和理論依據(jù)。 1.1 材料和試劑 所用的茶樹(shù)品種為特早生國(guó)家級(jí)茶樹(shù)品種龍井43，種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家種質(zhì)杭州茶樹(shù)圃。參照已報(bào)道的茶樹(shù)脅迫處理19-21及本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)結(jié)果22，從日光溫室中選取生長(zhǎng)正常且長(zhǎng)勢(shì)相近的3年生盆栽茶樹(shù)若干盆，分別在低溫(4)、ABA (100 mol L1)和NaCl (250 mmol L1SMART RACE cDNA Amplication Kit和Advantage Polymerase Mix購(gòu)于Clontech公司(Mountain View，CA，USA)；SYBR Prem

15、ix Ex Taq II (Perfect Real Time)、DNA Marker、TA Cloning Kit PCR2.1 Vector、大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞和Taq聚合酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品(大連)；DNase I Digestion of RNA Preparation、First-Strand cDNA Synthesis購(gòu)自Invitrogen公司(Carlsbad，USA)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司(California，USA)；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司(Tiangen，北京)。脫落酸(ABA)購(gòu)于SIGMA公司，NaCl、無(wú)水乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)?/p>

16、劑。由上海華津生物技術(shù)公司合成引物并測(cè)序。 )脅迫下試驗(yàn)。 1.2 總RNA提取和cDNA合成 參照離心柱型植物總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取茶樹(shù)葉片總RNA。檢測(cè)RNA濃度和完整性后于80保存?zhèn)溆?。? g總RNA為模板，參照SMART RACE cDNA Synthesis Kit的操作步驟合成5和3的cDNA，用于RACE擴(kuò)增，以及反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)擴(kuò)增基因的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框(ORF)和亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建的PCR擴(kuò)增；以5 g總RNA為模板，按照DNase I Digestion of RNA Preparation和First-Strand cDNA Synthesis試劑

17、盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，稀釋40倍后作實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。 1.3 CsbZIP1全長(zhǎng)cDNA克隆與生物信息學(xué)分析 1.3.1 茶樹(shù)CsbZIP1基因的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室茶樹(shù)冷馴化轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果(NCBI登錄號(hào)為SRA061043)，經(jīng)Blast比對(duì)篩選出與其他植物中報(bào)道的bZIP基因高度同源的EST序列，設(shè)計(jì)5和3-RACE特異引物5GSP/3GSP (表1)。參照SMART RACE cDNA Synthesis Kit的操作步驟進(jìn)行茶樹(shù)bZIP基因的PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94預(yù)變性4 min；94變性30 s，68退火30 s，72延伸2 m

18、in，30個(gè)循環(huán)；72延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶回收純化，連接到PCR2.1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌落，挑取10個(gè)白色單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，挑選34個(gè)陽(yáng)性菌落送上海華津生物公司測(cè)序。經(jīng)去載體、拼接，得到茶樹(shù)bZIP基因的5和3端序列，與中間序列拼接，得到bZIP基因的全長(zhǎng)cDNA序列。在ORF上、下游區(qū)域設(shè)計(jì)RT-PCR特異引物RT-F/RT-R (表1)，以PCR擴(kuò)增驗(yàn)證ORF序列。反應(yīng)條件為94 4 min；94 30 s，58 30 s，72 1 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序和拼接后，獲得完整的茶樹(shù)bZIP基

19、因全長(zhǎng)cDNA序列。 表1 試驗(yàn)引物及其序列 Table 1 Sequence of primers in research 引物名稱 Primer 序列 Sequence of primers (53) 引物名稱 Primer 序列 Sequence of primers (53) 5GSP TGGAAACCTTGTCTTGAGTTGCGG 3GSP TCGTGAAGCGGTTCGCAAGTATC RT-F CCTCTCATTCACACACTTGTCGTC RT-R CCAATCTCCCCTTCAATCCTCCC CsbZIP1-qRT-F CCTCGGATGTCCACAAGCAA CsbZ

20、IP1-qRT-R CGTGAAGCGGTTCGCAAGTA CsbZIP1-GFP-F AATAGGTACCATGGACGATGGGGAGATTGAT CsbZIP1-GFP-R ATAACTCGAGCCTTGCTGCACGAGTCCCTCCT 18S-F TCTCAACCATAAACGATGCCGACCAG 18S-R TTTCAGCCTTGCGACCATACTCCC 3 4 1.3.2 CsbZIP1生物(shngw)信息學(xué)分析 利用NCBI的BlastX和BlastP進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)分析；用DNAStar軟件查詢開(kāi)放(kifng)閱讀框；用ProtParam預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和

21、理論等電點(diǎn)；用SMART (http:/smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行保守(boshu)域分析；用DNAMAN進(jìn)行多序列氨基酸比對(duì)；用MEGA5.0軟件中的鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；用NetPhos 2.0 Serve (http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；用SWISS-MODEL (/workspace/) 和PyMol軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；用WoLF PSORT (/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。 1.4 CsbZIP1基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位 1.4.1 載體的構(gòu)建 以CsbZIP1-GFP-F/CsbZ

22、IP1-GFP-R為引物，擴(kuò)增CsbZIP1基因，純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用Kpn I和Xho I酶切，回收酶切產(chǎn)物；再用Kpn I和Xho I對(duì)P2GWF7質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)；最后，把酶切回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切片段連接，構(gòu)建載體P2GWF7-CsbZIP1，轉(zhuǎn)入DH5，菌液PCR、酶切篩選陽(yáng)性克隆, 并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。 1.4.2 P2GWF7-CsbZIP1轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞 取50 mgmL1金粉懸液50 L于離心管，依次加入5 L質(zhì)粒DNA (1 g L1), 50 L CaCl2 (2.5 mol L1)和20 L亞精胺(0.1 mol L11.5 CsbZIP1實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)

23、分析 )(每加完一樣可振蕩3 s)，靜置10 min；然后振蕩1 min，冰上10 min，9400g離心10 s，棄上清；再用80 L無(wú)水乙醇，洗滌沉淀一次；重新懸浮沉淀于10 L無(wú)水乙醇中；每次用10 L滴于微粒載膜中央，平鋪，晾至完全干燥，待用。取新鮮洋蔥，用無(wú)菌刀片切取肉質(zhì)較厚的34層鱗莖，用鑷子撕出表皮平鋪于MS培養(yǎng)基上，25預(yù)培養(yǎng)4 h。選用1100 psi的壓力膜，將10 L金粉DNA混合物滴在壓力膜中央，將洋蔥表皮放在瓊脂糖培養(yǎng)基上，采用PDS1000/He型基因槍(Bio-Rad)轟擊。將轟擊后的洋蔥表皮細(xì)胞25暗培養(yǎng)16 h后制片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。 以茶樹(shù)1

24、8S基因作為內(nèi)參基因，參照SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)的操作說(shuō)明書(shū)對(duì)CsbZIP1基因的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR分析，PCR體系為SYBR Premix Ex Taq 25 L、10 mol L1上下游引物各1 L、ROX Dye II 1 L、cDNA 2 L，加水至終體積50 L。反應(yīng)在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，程序?yàn)?5 15 s，94 5 s，60 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和融解曲線，采用2CT法分析結(jié)果232 結(jié)果與分析 ，每個(gè)樣品3次重復(fù)。 2.1 CsbZIP1基因的克隆及生物

25、信息學(xué)分析 2.1.1 CsbZIP1全長(zhǎng)cDNA克隆與序列分析 根據(jù)中間EST片段序列，設(shè)計(jì)5和3-RACE特異引物，分別擴(kuò)增出928 bp和410 bp的序列(圖1)，用Seqman軟件把3段序列拼接初步得到cDNA全長(zhǎng)，再查找其開(kāi)放閱讀框(ORF)，BlastX比對(duì)其ORF，在ORF上下游設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，擴(kuò)增得到813 bp的序列(圖1)。最終獲得該基因cDNA全長(zhǎng)序列1515 bp，包含813 bp的完整ORF，編碼270個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為7.175，推測(cè)分子量29.484 kD。NCBI比對(duì)分析結(jié)果表明，它含有bZIP家族典型的BRLZ結(jié)構(gòu)域，屬于B-zip1家

26、族；與可可(Theobroma cacao) EOX97663.1、大豆(Glycine max) NP- 001235033.1的氨基酸相似性分別為68%和66%。CsbZIP1蛋白與其他植物bZIP氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)表明，在N端具有保守的bZIP堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈(圖2)。對(duì)CsbZIP1氨基酸序列分析，顯示氨基酸序列第95127位為典型的bZIP堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(圖3)。因此，該基因?qū)儆赽ZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，并命名為CsbZIP1 (GenBank登錄號(hào)為JX050148.1)。 圖1 CsbZIP1的RACE及RT-PCR電泳結(jié)果 Fig. 1 Electroph

27、oresis results of RACE fragments and RT-PCR fragments of CsbZIP1 2000 bp 1000 bp 500 bp 2000 bp 1000 bp 500 bp 2000 bp 1000 bp 500 bp 5 M 3 M ORF M 5 圖2 CsbZIP1與其他(qt)植物同源bZIP的氨基酸多序列比對(duì) Fig. 2 Multiple amino acid alignment of CsbZIP1 with other plants homologous bZIP 黑色畫(huà)線標(biāo)記為bZIP家族(jiz)保守的N-x7-R/K-x9-

28、L-x6-L-x6Conserved sequence N-x-L序列(xli)。 7-R/K-x9-L-x6-L-x6 -L of bZIP family is underlined. 圖3 CsbZIP1的cDNA核苷酸序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列 Fig. 3 Nucleotide and putative amino acid sequence of CsbZIP1 圖中陰影部分為堿性結(jié)構(gòu)域(N-x7-R/K-x9)；下畫(huà)線部分為亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(L-x6-L-x6-L)，其中黑色反白標(biāo)識(shí)為亮氨酸(Leucine) The shaded parts are basic region (N-x7

29、-R/K-x9); underlined parts are leucine zipper motif; and black parts are leucine. 2.1.2 CsbZIP1蛋白與擬南芥bZIP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 根據(jù)Jakoby等4 對(duì)擬南芥bZIP亞家族的分類(lèi)，從每個(gè)亞家族挑選取23個(gè)擬南芥bZIP基因，采用MEGA5.0鄰近相連法對(duì)CsbZIP1與21個(gè)擬南芥bZIP氨基酸序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)，結(jié)果顯示CsbZIP1與擬南芥Group F聚為一類(lèi)，從理論上推測(cè)CsbZIP1屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子的F亞家族。 6 圖4 CsbZIP1蛋白(dnbi)與21個(gè)擬

30、南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析 Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of CsbZIP1 protein with 21 Arabidopsis bZIP proteins 2.1.3 CsbZIP1編碼蛋白(dnbi)的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 用NetPhos 2.0 Serve預(yù)測(cè)CsbZIP1蛋白磷酸化位點(diǎn)(圖5)表明，含有絲氨酸(Serine)、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)的多個(gè)(du )磷酸化位點(diǎn)中以絲氨酸位點(diǎn)最多，有13個(gè)，蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)各1個(gè)。由此推測(cè)磷酸化作用可能與CsbZIP1蛋白的活性調(diào)控有關(guān)。 圖5 CsbZI

31、P1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) Fig. 5 Phosphorylation site prediction of CsbZIP1 protein 2.1.4 CsbZIP1編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)CsbZIP1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)PyMol軟件模擬分析，得到CsbZIP1蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖(圖6)。結(jié)果顯示與Jakoby等4AtbZIP13 (At5g44080) 獲得的擬南芥bZIP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖相似，均含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子典型的-螺旋和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)獲得的CsbZIP1屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族。 AtbZIP14 (At4g35900) Group A

32、 AtbZIP25 (At3g54620) AtbZIP10 (At4g02640) Group C AtbZIP3 (At5g15830) AtbZIP5 (At3g49760) Group S AtbZIP41 (At4g36730) AtbZIP55 (At2g46270) Group G AtbZIP34 (At2g42380) AtbZIP61 (At3g58120) Group E AtbZIP69 (At1g06070) AtbZIP30 (At2g21230) Group I AtbZIP56 (At5g11260) AtbZIP64 (At3g17609) Group H C

33、sbZIP1 (AFP19452.1) AtbZIP19 (At4g35040) AtbZIP24 (At3g51960) Group F AtbZIP2 (At2g18160) AtbZIP20 (At5g06950) AtbZIP26 (At5g06960) Group D AtbZIP28 (At3g10800) AtbZIP49 (At3g56660) Group B Genetic distance NetPhos 2.0: predicted phosphorylation sites in CsbZIP1 Phosphorylation potential 0 50 100 15

34、0 200 250 Sequence position 1 0 7 圖6 CsbZIP1蛋白(dnbi)三維結(jié)構(gòu)圖 Fig. 6 The 3-D structure of CsbZIP1 protein 2.2 CsbZIP1編碼蛋白的亞細(xì)胞(xbo)定位 用WoLF PSORT軟件(run jin)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，CsbZIP1主要定位在細(xì)胞核內(nèi)。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位試驗(yàn)的結(jié)果也顯示CsbZIP1融合蛋白位主要定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖7)，但是細(xì)胞內(nèi)其他部位也檢測(cè)到微弱信號(hào)。bZIP定位在細(xì)胞核內(nèi)與它的功能密切相關(guān)。 圖7 CsbZIP1亞細(xì)胞定位 Fig. 7 Subcellular lo

35、calization of CsbZIP1 2.3 CsbZIP1在低溫、ABA和NaCl脅迫處理下的實(shí)時(shí)熒光定量分析 熒光定量PCR結(jié)果表明(圖8)，4低溫處理能夠誘導(dǎo)CsbZIP1的表達(dá)，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量在處理8 h最大，達(dá)到11.59，24 h降低為6.72。100 mol L1ABA處理后CsbZIP1的表達(dá)被抑制，2 h的相對(duì)表達(dá)量最低只有0.2，但隨著脅迫的繼續(xù)，表達(dá)量逐漸上升，在24 h時(shí)表達(dá)量升高到0.90，但沒(méi)有超過(guò)0 h的表達(dá)量。250 mmol L1 NaCl處理后，CsbZIP1的表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，處理4 h表達(dá)被誘導(dǎo)，表達(dá)量達(dá)3.86，隨著處理時(shí)

36、間延長(zhǎng)至24 h，表達(dá)量降低為1.21。CsbZIP1在低溫、高鹽和ABA 3種脅迫下均響應(yīng)，低溫能夠顯著誘導(dǎo)其表達(dá)，NaCl短時(shí)間內(nèi)也能上調(diào)其表達(dá)，ABA則能迅速抑制其表達(dá)。 Black Bright Combination 35S: GFP 35S: CsbZIP1-GFP -helix Leucine 8 圖8 逆境(njng)脅迫處理下CsbZIP1的相對(duì)(xingdu)表達(dá)量 Fig. 8 Relative expression of CsbZIP1 under stress treatments 3 討論(toln) bZIP作為一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，與植物逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，但在

37、茶樹(shù)上鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)RACE和RT-PCR技術(shù)克隆獲得茶樹(shù)中的一個(gè)bZIP基因，它與其他植物bZIP具有較高的同源性，序列分析表明含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族典型的堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(氨基酸序列第95127位)，屬于B-zip1家族，命名為CsbZIP1。CsbZIP1蛋白與擬南芥不同亞家族bZIP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示其與F亞家族聚為一類(lèi)。目前，植物中關(guān)于F亞家族和B亞家族的研究報(bào)道較少，但其他亞家族在ABA、逆境脅迫、種子發(fā)育、抗氧化、光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用以及糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用4,13,24；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明CsbZIP1蛋白含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能與bZIP蛋

38、白的活性調(diào)控有關(guān)。磷酸化和去磷酸化是ABA信號(hào)通路中的關(guān)鍵步驟，低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫能夠刺激植物體內(nèi)ABA含量增加，從而激活SnRK2蛋白激酶，將bZIP轉(zhuǎn)錄因子的保守域磷酸化，從而使bZIP蛋白活化，再通過(guò)與順式作用元件結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，以此來(lái)增強(qiáng)植物的抗逆性3,25-26亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示CsbZIP1蛋白最可能定位于細(xì)胞核，另外還可能定位在葉綠體、質(zhì)體和胞液。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CsbZIP1定位在核內(nèi)，通過(guò)洋蔥表皮亞細(xì)胞定位試驗(yàn)分析了它的亞細(xì)胞定位。試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果相近，CsbZIP1蛋白主要定位在細(xì)胞核，同時(shí)在細(xì)胞的其他部位也能夠檢測(cè)到微弱信號(hào)。這與其他植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞

39、定位研究報(bào)道相一致。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，CsbZIP1蛋白具有高度保守的由-螺旋和亮氨酸形成的bZIP結(jié)構(gòu)域，與報(bào)道的擬南芥AtbZIP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型相似。 11,14,27已有研究表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫，如干旱、低溫、高鹽等中參與調(diào)控基因表達(dá)。 2,9,13。本研究用qRT-PCR分析CsbZIP1在ABA、低溫和鹽脅迫下的表達(dá)模式。依據(jù)前人報(bào)道的茶樹(shù)脅迫處理結(jié)果及本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果，分別選用濃度100 mol L1和250 mmol L1的ABA和NaCl處理茶樹(shù)。低溫是限制茶樹(shù)生長(zhǎng)的最重要影響因子之一，但植物響應(yīng)低溫脅迫與ABA信號(hào)途徑可能密切相關(guān)，為了分析Csb

40、ZIP1在低溫和ABA處理后的表達(dá)模式變化，我們選取在處理后0、2、8和24 h的樣品試驗(yàn)。為了分析NaCl處理在短時(shí)內(nèi)對(duì)表達(dá)的影響，我們分析了處理后4 h的表達(dá)，通過(guò)與0 h和24 h時(shí)的表達(dá)比較，明確CsbZIP1在短時(shí)(4 h)內(nèi)的表達(dá)模式。結(jié)果表明，CsbZIP1對(duì)低溫和ABA處理的響應(yīng)模式不盡相同，ABA處理2 h表達(dá)被迅速抑制，從224 h的過(guò)程中，表達(dá)逐漸恢復(fù)到處理前的水平；低溫處理2 h則誘導(dǎo)其表達(dá)，且在處理的24 h內(nèi)表達(dá)均是上調(diào)的。說(shuō)明在低溫和ABA處理后，短時(shí)內(nèi)(2 h)調(diào)控作用相反，但在224 h過(guò)程中能夠誘導(dǎo)CsbZIP1表達(dá)，與處理前相比，低溫下的表達(dá)上調(diào)更顯著，表

41、明CsbZIP1在低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。鹽脅迫下，4 h時(shí)的表達(dá)被顯著上調(diào)，24 h的表達(dá)比4 h低，但仍比處理前0 h的表達(dá)量高，推測(cè)在處理24 h內(nèi)表達(dá)上調(diào)。Zou等28研究水稻bZIP基因表明，250 mmol L1大量的研究結(jié)果表明，不同的bZIP基因在逆境脅迫中的表達(dá)模式不盡相同。Liao等 NaCl處理24 h內(nèi)的表達(dá)量是上調(diào)的，且5 h的表達(dá)量最高。說(shuō)明NaCl處理對(duì)bZIP基因的誘導(dǎo)可能在45 h內(nèi)就能夠達(dá)到最大，這為以后深入研究其在抗鹽脅迫中的功能提供了參考。 8將大豆GmbZIP 44、GmbZIP 46、GmbZIP 62和GmbZIP 78 4個(gè)基因轉(zhuǎn)到擬南芥

42、中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因均能增強(qiáng)對(duì)高鹽和低溫逆境的抗性，而GmbZIP 44、GmbZIP 62和GmbZIP 78的過(guò)表達(dá)能減弱ABA的敏感性，表明這3個(gè)基因有可能通過(guò)上調(diào)ABI1和ABI2基因的表達(dá)來(lái)參與ABA信號(hào)途徑，對(duì)ABA、鹽和低溫逆境起負(fù)調(diào)控作用。Zou等28對(duì)水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因OsABI5的表達(dá)研究表明，4低溫處理24 h后，前5 h的表達(dá)量是下調(diào)的，10 h后表達(dá)量逐漸上調(diào)。Orellana等29分離的番茄bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因SIAREB1同時(shí)受ABA9 和NaCl脅迫(xip)誘導(dǎo)，100 mol L1 ABA處理24 h后，SIAREB1在葉片和根中的表達(dá)量是上升(s

43、hngshng)的；300 mmol L1 NaCl處理72 h后，葉片(ypin)和根中的表達(dá)量都是在6 h最大，其后表達(dá)量降低。Ying等11克隆的玉米ZmbZIP72基因的表達(dá)結(jié)果顯示，NaCl脅迫(200 mmol L1)處理24 h后，表達(dá)量是增加的，且在24 h表達(dá)量最大；而4低溫處理24 h后，表達(dá)量變化不大。Gao等6研究大豆GmbZIP1在不同逆境脅迫下的表達(dá)結(jié)果表明，4低溫處理24 h后，GmbZIP1的表達(dá)量是逐漸升高的，24 h的表達(dá)量最大，與本試驗(yàn)4低溫表達(dá)模式相似。另外，Schlgl等30對(duì)甘蔗bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因研究發(fā)現(xiàn)，在100 mol L1ABA處理12 h后

44、，ScbZIP29和ScbZIP31的表達(dá)量是上調(diào)的，而ScbZIP24的表達(dá)量是下調(diào)的，這與本試驗(yàn)的ABA表達(dá)模式是相似的?？梢?jiàn)，bZIP基因在ABA信號(hào)途徑中可能起正調(diào)控作用，也可能是負(fù)調(diào)控作用。CsbZIP1可能還參與其他生物學(xué)功能，Cheng等31References 認(rèn)為F亞家族的bZIP轉(zhuǎn)錄因子可能參與植物的光形態(tài)建成，茶樹(shù)bZIP的功能及其他家族基因有待后續(xù)發(fā)掘。但是，從表達(dá)結(jié)果來(lái)看，CsbZIP1極有可能與茶樹(shù)低溫、鹽、ABA脅迫等方面有密切關(guān)系。 1 Xu Z S, Chen M, Li L C, Ma Y Z. Functions and application of th

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