1、植物 細胞培養2014Haberlandt第一節 植物細胞培養失敗原因實驗材料都是已經高度分化的細胞；培養基過于簡單，特別是沒有生長激素（未發現）。20世紀初，Haberland進行了分離和培養顯花植物單個葉細胞的最早嘗試。小野芝麻和鳳眼蘭的柵欄細胞 虎眼萬年青屬表皮細胞首次進行離體細胞培養（細胞未分裂）1902年發表植物離體細胞培養實驗，提出胚囊液在組織培養中的作用和看護培養法的科學預見。他當時就預見到，單細胞培養系統將有助于對植物細胞特性和潛力的研究 以及對多細胞有機體細胞間相互關系的了解。現在，不僅能夠培養游離細胞，還能使離體單細胞發生分裂，并產生完整植株。植物細胞培養（plant ce

2、ll culture）是指對植物器官或愈傷組織上分離出的單細胞（或小細胞團）進行培養，形成單細胞無性系或再生植株的技術。一、單細胞培養（一）單細胞的分離* 1. 機械法 Ball等（1965）最早由花生成熟葉片得到了離體單細胞。其方法是：首先撕去葉表皮，使葉肉細胞暴露，然后用解剖刀把細胞刮下來，直接接種在液體培養基中培養。Rossini（1972）只有在薄壁細胞組織排列松散、細胞間接觸面很小時，用機械法分離葉肉細胞才能成功。因此并不適合所有植物。現在廣泛用于分離葉肉細胞的方法先把葉肉組織輕輕研碎，然后再通過過濾和離心將細胞純化。具體過程在研缽中放入10g葉片和40ml研磨介質 （20mol蔗糖

3、+10molMgCl2 +20molTris-HCl緩沖液，） 輕輕研磨 用雙層紗布過濾 低速離心， 游離細胞就會沉降到試管底部，得到純化細胞。機械法分離細胞的特點A. 細胞不受酶的傷害；B. 不會發生質壁分離； 對生理、生化研究意義很大。C. 一般機械分離的細胞能夠發生分裂并形成愈傷組織。2. 酶解法Takebe等（1968）最早用果膠酶處理煙草分離出大量具有代謝活性葉肉細胞。利用果膠酶（pectase）處理葉片，使細胞間的中膠層發生降解，分離出具有代謝活性的細胞。 Takebe等煙草葉片葉肉細胞的分離方法（酶解法）A. 取煙草植株上充分展開的葉片進行表面消毒， 無菌蒸餾水沖洗干凈；B. 用

4、鑷子撕去下表皮，用解剖刀將撕去下表皮的葉片切成4cm4cm小塊；C. 放入經過過濾滅菌的酶液（含果膠酶0.5%+甘露醇0.8%+硫酸葡聚糖鉀1%）中， 用真空泵抽氣，使酶液滲入葉肉組織內；D. 在搖床上保溫培養，每30min更換一次酶液； 第1次30min后，換出的酶液去掉， 第2次30min后，酶液中主要分離出海綿薄壁細胞， 第3和第4次后，主要分離出柵欄細胞。酶液：果膠酶0.5%+甘露醇0.8%+硫酸葡聚糖鉀1%作為原生質膜的穩定劑的硫酸葡聚糖鉀（1%）， 降低酶液中核糖核酸酶的活力， 保持質膜的穩定性， 提高游離細胞的產量。 用于分裂細胞的果膠酶（0.5%） 不僅降解中膠層， 還能軟化細

5、胞壁。 作為滲透調節劑甘露醇（0.8% ）， 防止細胞脹裂。3. 由愈傷組織分離單細胞愈傷組織誘導 材料自來水沖洗75%的乙醇擦洗將材料切成小塊（帶形成層）接種，MS+2,4-D 2mg/L+水解酪蛋白（CH） 500mg/L+瓊脂0.8%， 產生愈傷組織擴大繁殖（提高愈傷組織松散性）。單細胞分離愈傷組織（未分化、易散碎）轉入液體培養基， 振蕩（120r/min）培養（弱光或黑暗，251）； 200m網篩過濾，離心 60-100m，20-30m無菌網篩過濾，離心回收，液體培養基沖洗，用于培養疏松愈傷組織懸浮振蕩培養將愈傷組織在液體培養基中培養，建立懸浮培養物振蕩作用形成小細胞團或單細胞；在培養

6、基中均勻分布；有空氣交流。單細胞培養就是對分離得到的單個細胞進行培養，誘導其分裂增殖，形成細胞團，再通過細胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直至長成完整植株的技術。它是常用的細胞培養方法。培養中的細胞在遺傳和生理生化上會出現變異，形成的植株就表現出一定的差異（這種差異主要反映在它們的產量、品質、抗病蟲和抗逆性等方面）。可以用于突變體篩選，選育出符合生產需要的新品種。（二）單細胞培養* 平板培養看護培養微室培養條件培養單細胞培養的方法1.平板培養把單個細胞與融化的瓊脂培養基均勻混合，并平鋪一薄層在培養皿底上的培養方法。 廣泛應用于細胞、原生質體及融合產物的培養。 具體步驟a. 細胞計數 先對含有游

7、離細胞和細胞團的懸浮培養物進行細胞計數，得到細胞密度。b. 過濾 然后進行過濾，除去較大的細胞團。 留下游離的單細胞和小細胞團，從而得到單細胞無性系。c. 接種將含有瓊脂的培養基滅菌后，冷卻到35，放到恒溫水浴中，將細胞懸浮液接種進去，充分混合后倒入培養皿中。當培養基凝固后，細胞能均勻分布并固定在很薄一層（約mm厚）培養基中。然后用封口膜封嚴，用雙筒倒置顯微鏡（40）的直接計量細胞數。平板培養注意事項選用的培養基無論是條件培養基還是合成培養基， 其目的是能夠在低的起始密度下使細胞生長；不可選用處在靜止期過久的細胞， 因為只有處在分裂旺盛時期的細胞才有較高的細胞分裂能力；在固體培養基中適宜的起始

8、密度因不同的植物種類不同；接種細胞時固體培養基的溫度要嚴格控制，一般不超過35， 溫度低，對細胞傷害小，但分布不均。在細胞培養中，培養液中的細胞密度隨著培養的進行，超過一定限度的高值，增殖速度下降，不久細胞數的增加便停止下來，此時期稱為靜止期。 2. 看護培養用同種或異種材料的愈傷組織作為看護組織。由Muir等1954年設計的。把單細胞放在一塊活躍生長的愈傷組織上進行培養，在愈傷組織和培養的細胞之間有一片濾紙相隔。（1）取處于活躍生長期愈傷組織塊， 無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養瓶中。（2）在愈傷組織上放mm8mm的無菌濾紙片，置培養室中放過夜。 使其充分吸收組織上滲透出的培養基成分和組織塊

9、的代謝產物。（3）從懸浮培養物或疏松的愈傷組織上分離出單細胞， 并把單細胞接種在培養瓶中的濾紙上面。（4）恒溫培養 當這個培養的細胞長出微小的細胞團后， 將它轉到瓊脂培養基上，以便進一步促進其生長。具體步驟由Jones等1960年設計的，人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細胞培養在小室中的少量培養基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。小室可通過毛細管與外界通氣，便于觀察。 注意：載玻片厚度1mm，微室厚度最好不超過20m， 蓋玻片厚度在左右，觀察效果才好。此法的優點 在培養過程中可以連續進行顯微觀察， 把1個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全過程記錄下來。 3. 微室培養現在可使用特制的凹穴載

10、玻片與蓋玻片做成單細胞培養的小室進行培養，也稱”雙層蓋玻片法” 由懸浮培養液中取出一滴只含有單細胞的培養液，放在一張無菌載玻片上， 在這滴培養液四周與其相隔一定距離加上一圈石蠟油，構成微室的“圍墻”。 在“圍墻”左右兩側再各加一滴石蠟油， 再在每滴石蠟油上放一張蓋玻片作為微室的“支柱”， 然后將第3張蓋玻片架在兩個支柱之間，構成微室的“屋頂”。 這樣含有細胞的培養液被覆蓋于微室之中， 構成圍墻的石蠟油能阻止微室中水分的丟失，且不妨礙氣體的交換， 最后把有微室的整張載玻片放在培養皿中培養。微室制作 當合成培養基中的細胞或細胞培養由于起始密度太低而不能發生分裂時， 可采用條件培養基。 所謂條件培養

11、基是在培養基中加入高密度的細胞進行培養， 一定時間后這些細胞就會向培養基中分泌一些物質，使培養基條件化。 方法 把液體培養基中培養了4-6周的高密度細胞慮掉， 將其培養基制成液體培養基或固體培養基 來培養單細胞或低密度細胞群體， 這樣可明顯提高單細胞培養物存活和分裂的能力。4. 條件培養基培養細胞懸浮培養（suspension culture）是使離體的植物細胞懸浮在液體培養基中進行的無菌培養。建立在愈傷組織的液體培養技術基礎上。目前已發展到全自動控制的大容積發酵罐的大規模工業生產的連續培養。為研究細胞的生長和分化提供了一個獨特的實驗系統。二、細胞懸浮培養 懸浮培養的優點 能提供比較均勻一致的

12、細胞； 細胞增殖速度比愈傷組織快； 適宜大規模培養，成為細胞工程中獨特的產業。日本大量培養人參細胞，并從中取得人參皂甙等有效成分；德國培養洋地黃取得療效高、毒性低的強心甙。中國正在進行人參、三七、三分三、貝母、紫草、紫杉等， 藥用植物的細胞培養，其發展前景十分誘人。細胞懸浮培養中，采用生長快、有效成分高、適合懸浮培養的細胞株。（1）從培養的愈傷組織中挑選出外觀疏松、生長快的淺色愈傷組織。（2）用振蕩或酶法，游離出單個細胞或小細胞團。（3）接種在固體培養基上培養2周。（4）挑選生長快的細胞株并繼代培養。（5）取各細胞系的培養物，進行有效成分的測定， 篩選出有效成分高而生長較快的細胞株。篩選細胞株

13、的方法細胞懸浮培養1. 分批培養（batch culture）是指把細胞分散在一定容積的培養基中進行培養，當培養物增殖到一定量時，轉接繼代，建立起單細胞培養物。在培養過程中除了氣體和揮發性代謝產物可以同外界交換外，一切都是密閉的。 分批培養所用的容器一般是100-250mL三角瓶， 每瓶裝20-75mL培養基。 為了使分批培養的細胞不斷增殖，必須及時進行繼代。（一）培養類型和方法繼代的方法 可以是取出培養瓶中一小部分懸浮液， 轉接到成分相同的新鮮培養基中； 也可用紗布或不銹鋼網進行過濾，濾液接種， 這樣可以提高下一代培養物中單細胞的比例。根據培養基在容器中的運動方式來區分，有以下4種方法： 旋

14、轉培養 往返振蕩培養 旋轉振蕩培養 攪動振蕩培養分批培養的方法分批培養優點 1） 設備簡單； 2） 操作簡單、重復性好。缺點 1） 培養基成分在不斷改變，沒有一個穩定生長期； 2） 細胞數目、代謝產物等不能保持恒定。 2. 半連續培養是利用培養罐進行細胞大量培養的一種方式。當培養罐內細胞內細胞數目增殖到一定量后，倒出一半細胞懸浮液于另一個罐內，再分別加入新鮮培養基繼續進行培養，如此這樣頻繁地進行再培養。是利用特制的培養容器進行大規模細胞培養的一種方式。 在培養過程中，以不斷抽取懸浮培養物，并注入等量新鮮培養基，使培養物不斷得到養分補充，保持其恒定體積的培養。連續培養的特點由于不斷加入新鮮培養基

15、，保證了養分的充分供應， 不會出現懸浮培養物發生營養不足的現象。可在培養期間使細胞保持在對數生長期，細胞增殖速度快。適于大規模工業化生產。3. 連續培養（continue culture）（1）封閉型連續培養在培養過程中，排出的舊培養基由加入的新鮮培養基進行補充，進出數量保持平衡，從而使培養系統中營養物質的含量總是超過細胞生長的需要。 懸浮在排出液中的細胞經機械方法收集后再放回到培養系統中，因此，隨培養時間的延長，細胞密度會不斷增加。（2）開放型連續培養為了不使限制細胞生長的因子出現，創造一個穩定的培養細胞生長的環境，必須建立一套自動控制系統來調節培養基注入的數量和培養液的總體積。在開放連續培

16、養中，注入的新鮮培養液的容積與流出的培養液容積相等，其中細胞密度保持恒定，通過調節流入和流出的速度，使細胞的生長速度一直保持一個穩定狀態，流出的細胞數目相當于培養系統中新細胞的增加數。連續培養是植物細胞培養技術中的一個重要進展，對于植物細胞代謝調節的研究、 各個生長限制因子對細胞生長的影響 以及對次生物質的大量生產等都有重要意義。排除細胞不返回培養罐（二）懸浮細胞的繼代為了保持一定的懸浮培養細胞增殖速度和增殖量，應定期做繼代培養，最適的周期一般為1-2周，但實際所需時間和接種量應視不同細胞系而定。1周-1:4接種2周-1:10接種培養基一般就用誘導愈傷組織生長的固體培養基成分（不加瓊脂）。但有

17、時也需調節激素的濃度和比例。振蕩破碎成小細胞團或單細胞，并均勻分散；促進氣體交換。（三）懸浮細胞振蕩大多數細胞同時通過細胞周期的某個階段，同步性程度以同步百分數表示。同步性程度參數在某一時刻處于細胞周期某一點上的 細胞的百分數；在一個短暫的具體時間內通過細胞周期 中某一點的細胞的百分數；全部細胞通過細胞周期中某一點所需的 總時間占細胞周期時間長度的百分數。（四）懸浮培養細胞的同步化研究細胞分裂和細胞代謝懸浮培養細胞的同步化方法一般情況下，懸浮培養細胞都是不同步的。同步化的方法1.物理方法通過對細胞物理特性（細胞或小細胞團的大小） 或生長環境條件（光照、溫度等）的控制，實現高度同步化。包括按細胞

18、團的大小進行選擇的方法 和低溫休克法等。2. 化學方法1）饑餓法先對細胞斷供一種進行細胞分裂所必需的營養成分（硝酸鹽、磷酸鹽等）或激素（細胞分裂素或生長素），使細胞停留在G1或G2期，經過一段時間的饑餓后，培養基中重新加入這種限制因子，靜止細胞就會同步進入分裂。2）抑制法使用DNA合成抑制劑（5-氨基尿嘧啶、FUdR、羥基尿和胸腺嘧啶脫氧核苷）使細胞周期只能進行到G1期為止，細胞都滯留在G1期 - S期的邊界上。去掉抑制劑后，細胞進入同步分裂。氮、乙烯也能誘導細胞的同步性。三、影響細胞培養的因素1. 培養基單子葉：N6、MS、B5等；雙子葉：MS、B5、LS、SL等。Rossini（1972）

19、、Joshi &Ball（1968）培養基可用于離體葉肉細胞培養。2. 初始植板細胞密度較高（104或105細胞/ml），容易培養，要求培養基簡單，與懸浮培養或愈傷組織培養培養基近似。較低時，對培養基要求更復雜，加入一些有機附加物（椰子汁、水解酪蛋白或酵母浸出液等），利于細胞培養。3. 植物生長調節劑細胞培養使用激素時，除考慮對細胞分裂影響外，還要考慮對細胞分散性的影響。，KT為時顛茄細胞分散性最好。4. pH和二氧化碳濃度pH在細胞懸浮培養時變化較大，可加EDTA防止鐵及其他金屬離子沉淀和氧化；也可加一些微溶的固體緩沖物（磷酸鈣、碳酸鈣等）穩定培養基pH。低密度細胞培養中，二氧化碳誘導細胞分

20、裂具有重要意義。第二節 植物細胞生長和活力的測定一、懸浮培養中細胞生長的測定懸浮培養中，為了計算細胞的繁殖速度，常要測定細胞的增殖指標。1. 細胞數目由于在懸浮培養中存在大小不同的細胞團，培養瓶中直接取樣很難進行可靠的細胞計數。先用鉻酸（5-8%）或果膠酶（0.25%）進行處理，使細胞和細胞團分散，可提高細胞計數的準確性。Street等方法 1份培養物 加入到2份8%三氧化鉻溶液 70，2-15min 冷卻 用力振蕩10min 血球計數板計數。2. 細胞密實體積（PCV）即每毫升培養液中細胞總體積的毫升數。取一定體積的分散均一的懸浮液，2000g，離心5min。3. 細胞鮮重和干重懸浮培養物經

21、濕尼龍網（已知重量）過濾用水洗去培養基真空抽濾除去細胞上沾著的多余水分稱重（鮮重）。 60 ，24hr，稱重得到干重。另外還有 細胞有絲分裂的指數：處于有絲分裂細胞百分數。 植板率 = 每個平板形成的細胞團數/接種細胞總數1001. 四唑鹽還原法（TTC法）活細胞呼吸作用產生還原力，TTC還原成紅色染料，用分光光度計定量測定呼吸。2. 熒光素二乙酸法（FDA法）FAD進入活細胞后，被酯酶裂解釋放熒光素，熒光素積累在細胞質，紫外燈照射產生綠色熒光。3. 伊凡藍染色法活細胞不染色，死細胞染色。另外，還可用相差顯微鏡觀察細胞質環流及細胞核存在與否。二、培養細胞活力的測定一、植物次生代謝產物的生產1.

22、 生產天然的植物成分植物很多次生代謝物是藥物、染料、香精和色素等的重要來源。海巴戟培養細胞蒽醌含量比天然細胞高20倍。胡蘿卜 - 花青苷長春花 - 利血平（高血壓）和阿馬靈三七 - 三七皂苷第三節 植物細胞培養的應用2. 生物轉化通過生物系統的生理生化反應，轉化、合成新的有機物，給細胞提供人工合成的化合物、中間產物類似物、其他物種的植物產物，可合成自然界中不存在的化合物；給細胞提供天然產物的中間產物，提高天然化合物產量。細胞培養的增殖速度快，適合大規模懸浮培養，利于工廠化生產。二、突變體選擇使用單細胞系統，各種化學物質和放射性物質可以很快作用于細胞，又可以很快地停止這種作用。避免對組織、器官誘

23、導形成嵌合體；提高獲得隱性突變體的機會。三、誘導多倍體遠緣雜種可能不育，染色體加倍可恢復其育性。細胞培養可產生多倍體植株，并可人工加倍。（1）以單細胞為處理對象， 誘變后得到的是單細胞起源的遺傳穩定的非嵌合體或同質突變體；（2）可在有限空間同時處理大量旺盛生長細胞， 大大提高突變率和選擇效率；（3）細胞水平誘導周期短、不受季節限制， 縮短育種年限。單細胞培養可改善常規誘變育種的缺點一、人工種子的概念及意義 1977年，Murashige首先提出胚狀體的設想以及人工種子的概念。 人工種子一般是指植物材料在離體培養條件下， 獲得大量的高質量的成熟胚狀體， 把這些胚狀體外面包上有機化合物，作為保護胚狀體及提供營養的“種皮”， 從而創造出與真種子類似的結構。 人工種子包括體細胞胚、人工胚乳和人工種皮三部分。第四節 人工種子*人工種子在本質上屬于無性繁殖體，1. 使自然條件下不易結實或種子昂貴的材料能快速繁殖和保存；2. 繁殖速度快；3. 固定優良性狀（如雜種優勢）；4. 由于從任何材料都能得到胚狀體， 為基因工程技術應用于生產提供橋梁；5. 在人工種子的制作中，加入各種營養成分或生長調節劑