1、一株雞白痢沙門氏菌的分離與鑒定畜牧獸醫專接本0901:竇莉莎指導老師：陳素娟摘要：雞白痢沙門氏菌病是危害雛雞和成年雞的一種接觸感染性疾病。2010年10月， 揚州一養雞戶送來數只雞至揚州大學動物醫院就診，根據流行病學的調查、臨床癥狀、 剖檢的病例變化以及實驗室診斷，確診為雞白痢沙門氏菌病；同時還對分離出的雞白痢 沙門氏菌菌株進行藥敏試驗，并根據藥敏試驗結果及時調整用藥方案，從而使病情迅速 得到控制。關鍵詞：雞白痢沙門氏菌；分離；鑒定Isolation and identification of Salmonella puttorumUndergraduate: Lisha Dou Adviso

2、r: Sujuan ChenAbstract： Pullorum disease is an acute systemic disease in chicken. In October 2010, one chick-farmer sent a few chicken to Yangzhou University animal hospital for diagnosis from Yangzhou. According to the investigation of epidemiology, the symptom of clinic, the change of pathology an

3、d the diagnosis of laboratory, they were infected by Salmonella pullorum disease. Meanwhile, We also carried out the drug sensitive test about the Salmonella pullorum isolated. According to the result of the susceptibility test, We adjusted the drug regimen in time and the disease was controlled qui

4、ckly.Key words: Salmonella pullorum; Isolation; Identification文獻綜述雞白痢沙門氏菌(S. pullorum)病(簡稱雞白痢)是危害雛雞和成年雞的一種接觸感 染性疾病。該病呈急性或慢性敗血癥過程，在雛雞和成年雞中所表現的癥狀和病程有顯 著不同。雛雞主要表現為白色下痢、急性敗血癥、氣喘、呼吸困難并帶肝臟、心肌肺器 官出現壞死、結節或壞死灶為主要的臨床病理特征，發病率、死亡率較高，是嚴重危害 雛雞的一種常見疾病。成年雞多為慢性或隱形感染，成年雞感染后呈纖維素性腹膜炎、 肝腫大、腸道腫脹出血等特征1- 3。病原1.1細菌學檢查雞白痢的病原

5、是雞白痢沙門氏菌（S.Pullorum。其形態為兩端稍圓的細長桿菌（0.3 0.5pm x12.5pm），革蘭氏染色陰性，不運動，無莢膜，不形成芽孢，兼性厭氧。外界 環境中耐寒，不耐熱，在沸水中立即死亡，但在蛋內需煮沸5min方可殺死，一般消毒劑 在短時間內都能將其殺死。該菌僅感染雞與火雞，在病雞的肝、肺、腸、卵黃囊、心及 血液中含菌量最高。1.2形態觀察將純培養物進行涂片染色鏡檢，見有革蘭氏陰性較短而細小的桿菌，無芽胞及莢 膜。13培養特性將純培養物分別接種在普通瓊脂、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂平板及普通肉湯中經37C 培養24h后，在普通瓊脂平板上長出圓形、邊緣整齊、濕潤、稍隆起的光滑菌落；在血

6、 瓊脂平板上菌落特點與普通瓊脂平板上相同，未見有溶血現象；在麥康凱瓊脂上生長出 透明而稍帶黃色的菌落，其大小、形狀與鮮血平板相同；在普通肉湯中肉湯輕度混濁， 管底有絮狀沉淀，無菌膜及菌環。流行特點各品種的雛雞對白痢都有易感性，在3日齡以前發病率和死亡率都很高，病程有時 可延續到3日齡以后。雞白痢的主要傳染源是病雞和帶菌雞，傳染途徑主要是消化道， 既可水平傳播又可垂直傳播。帶菌雞的卵巢和腸道含有大量病菌，病雞排出的糞便中含 有大量的病菌，它容易污染飼料、墊料、飲水及飼養用具，當雛雞接觸到這些污染物之 后則被感染。感染雞所產的蛋內含有多量的病菌，對有啄蛋或食蛋癖的雞也可感染。用 病雞所產的帶菌種蛋

7、，或使用被病菌污染的孵化機進行孵化，都可傳染白痢。因為剛出 殼的雛雞，抗病力很差，攝食到含有病菌的塵埃后，往往很快發病。飼養管理不良，如 雛雞擁擠，飼養密度過大，環境衛生不好，溫度過高過低，通風不良，飼料品質差或營 養不全，以及有其他疫病感染時，都可成為誘發白痢的因素。此外，通過斷喙、性別鑒定及蒼蠅、老鼠也能傳播白痢。臨床癥狀帶菌種蛋孵出的雛雞出殼后不久可見虛弱昏睡，進而陸續死亡。常但7日齡發病 量增加，10日齡達到死亡高峰。出殼后感染的雛雞，一般在510日齡開始發病，23 周齡雛雞白痢發病和死亡達到高峰。病雛精神萎靡，不喜歡活動，閉目打瞌睡，縮頸低 頭，兩翅下垂，后軀下墜，怕冷，靠近熱源，多

8、數病雛呼吸困難而急促，后腹部快速地 一收一縮。病雛排糞時常發出“嘰嘰”的痛苦尖叫聲，排出白色、漿糊狀糞便，肛門周 圍的絨毛常被糞便污染并與糞便粘在一起，干結后形成硬塊，堵塞肛門。3周齡以后， 發病的雛雞一般很少死亡。成年雞一般無明顯癥狀，母雞表現為產蛋量、受精率和孵化 率下降，極少數的病雞精神萎頓，食欲減少，產蛋停止，排白色糞便，有的可因卵黃囊 炎引起腹膜炎，使腹膜增厚，腹部下垂2。剖檢病變4.1雛雞早期死亡的急性病雛，剖檢時無明顯病變，可見肝輕度腫大充血，間有出血，膽囊 擴張，充有多量膽汁，肺臟充血或出血。病程稍長，病雞卵黃吸收不全，其內容物呈油 脂狀或豆腐渣樣。病死雛消瘦，嗉囊擴張，脾腫大

9、、充血，磚紅色，有很特殊的條紋； 肝、脾、心及肌胃上面有灰白色結節。盲腸有白色的干酪樣堵塞物。泄殖腔有白色惡 臭稀便。4.2育成雞病雞一般營養中等或偏下。突出的變化是肝臟腫大，有的肝臟較正常肝臟大數倍； 脾臟腫大；心包增厚，心包擴張，心包膜呈黃色不透明，心肌可見有數量不一的黃色壞 死灶，嚴重的心臟變形、變圓，整個心臟被壞死組織代替；相同的變化還經常在肌胃上 見到；腸道呈卡他性炎癥。4.3成年雞母雞呈慢性經過。最典型的病變是卵巢上卵泡變形、變色，晦暗無光。卵內容物 呈干酪樣，有時卵泡破裂引起卵黃性腹膜炎，或有卵黃堵塞輸卵管。公雞睪丸極度萎縮，睪丸炎，輸精管增大，并充滿稠密的滲出物，心囊積液。診斷

10、雞白痢沙門氏菌病可根據流行病學特點，臨床癥狀、剖檢變化綜合分析，做出初步 診斷，但其他病原微生物感染也會出現類似的剖檢變化，還要考慮有無混合感染的問題， 所以確診還要通過病原分離培養，染色鏡檢、生化試驗、致病性試驗等6。防制要以預防為重點，從種雞做起，種雞場應定期進行檢疫，淘汰陽性種雞，取干凈的 種蛋入孵，從孵化到育雛的各個環節要嚴格消毒。61預防本病傳染源主要為病雞和帶菌雞，傳播途徑有水平傳播和垂直傳播。帶菌公雞可通 過精液將病原傳給母雞，因此公雞的白痢凈化尤為重要。對種雞的雞白痢凈化和對種蛋 徹底進行消毒是控制該病發生的重要措施，對預防初生雛雞白痢尤其重要。出殼雛雞用 敏感藥物預防性加藥有

11、很好的控制作用；堅持自繁自養，如確需引進，而需對引進雞場 進行雞白痢檢測咨詢，確定為無雞白痢雞群后，方可引進；對種蛋進行嚴格的熏蒸消毒。 加強育雛期衛生，定期對環境及各種育雛器械進行消毒，以便殺滅環境中的細菌。各種 應激因素：如飼養密度大，長途高溫或低溫運雛，通風不良，舍內溫度過高或過低，衛 生條件不良，飼養管理不善等，都可誘導雞的發病。應減少應激因素，改善飼養管理， 提高育雛雞營養水平，加強雞的抵抗力。雛雞、產蛋雞、種雞不要亂投藥，應根據藥敏試驗的結果選擇敏感藥物防治雞白痢 病，注意地區耐藥菌株的出現，要定期給種雞投藥，加強雞舍消毒，消除沙門氏菌的帶 菌污染。若其中有一個種雞場白痢凈化后未進

12、行雞舍消毒，結果不出一個月必將導致雞 白痢的污染，重測時白痢陽性率增高。在剛出殼時雛雞進行敏感藥物注射或飲水預防雛 雞白痢，有很好的預防效果，一般在15日齡和710日齡時各加藥一個療程。6.2治療6.2.1早用藥在雛雞首次開食和飲水時就添加防治雞白痢病的藥物，不要等到第二天或第三天， 甚至出現臨診癥狀后再加藥。6.2.2 藥量:足每千克飲水中加5%氟哌酸3g ；每千克飼料中拌0.1%片痢特靈34片，但應注意將 藥物和飼料拌均勻。6.2.3按療程用藥治療雞白痢藥物在沒有特別說明的情況下，一般都以連續用藥3天為一個療程。不 足3天，由于用藥時間短，達不到預防和治療雞白痢的目的；超過3天，除容易產生

13、抗藥 性外，又容易造成藥物在體內蓄積而使雞群中毒。6.2.4交替用藥為防止細菌對藥物產生抗藥性和雞群因用藥時間過長而中毒，抗雞白痢藥物應交替 使用。第一個療程結束后，緊接著從8日齡開始，每10千克飲水中加入恩諾沙星5g，連 飲7天；每千克飼料中加入土霉素34g，連喂7天。以后再根據雞群情況加喂其它抗雞 白痢藥物，或重復第一個療程。6.2.5科學飼養根據上面的防治方案，能夠有效地預防和治療雛雞白痢病，但要徹底杜絕該病的發 生，必須建立一整套科學的飼養管理程序，并貫徹于育雛、育成、種雞飼養、種蛋的收 集、消毒、孵化等整個養雞的全過程。正文部分雞白痢沙門氏菌（S . pullori）m病（簡稱雞白痢

14、）是危害雛雞和成年雞的一種接觸感 染性疾病。雞白痢是由雞白痢沙門菌引起的一種多發性傳染病，雛雞發病表現急性敗血 癥經過，以發熱、拉灰白色粥樣或黏性液狀糞便為特征；成年雞發病以生殖系統損害為 主的慢性或隱性感染為特征。由于我國集約化養雞業的快速發展，雞病的種類逐漸的增 多；另外由于各類抗生素藥物的廣泛應用、長期應用、不足量應用、反復應用，使某些 菌株產生耐藥性，使用藥物治療時療效不明顯。2010年10月，揚州一養雞戶送來數只 雞至揚州大學動物醫院就診，根據病史和流行病學的特點，病理解剖變化，初步診斷為 雞白痢沙門氏菌病，并對其進行細菌進一步分離和鑒定。11病例1.1.1病料來源病料來源于初步診斷

15、為雞白痢沙門氏菌病的12日齡草雞3只。1.1.2臨床癥狀發病雞癥狀表現為精神委靡，羽毛蓬松雜亂，兩翅下垂，食欲不振或廢絕，雞冠蒼 白皺縮，排黃綠色和白色稀糞，沾污肛門周圍羽毛。1.1.3剖檢變化病死雞只剖檢可見肝腫大變脆，充血，色淡發黃；腸壁變薄，有出血點。無菌采取肝 臟典型病料放于無菌的平皿里，放A4C冰箱里冷藏，以備用。1.2培養基1. 2.1LB培養基：稱取蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g于蒸餾水中至950ml，溶解 完全，用10N的NaOH調PH于7.0后定容至1000ml，分裝，按1.5% (m/v)的瓊脂粉 加入，121C 15min高壓滅菌，澆板。1.2.2麥康凱培養基：5

16、4g麥康凱加5g瓊脂粉，加蒸餾水至1000ml，分裝，115C30min 高壓澆板。1.3染色液1.3.1草酸銨結晶紫染色液：取結晶紫飽和酒精溶液2mL，加蒸餾水18mL稀釋10倍，再 加入1%草酸銨水溶液80mL，混合過濾即成。1.3.2革蘭氏碘液：先用少量蒸餾水將2g碘化鉀溶解，然后再加入1g已磨碎的碘片，并徐 徐加水，待完全溶解后，注入瓶中，并加蒸餾水至全量為300mL即成。可保存半年以上， 當產生沉淀或褪色后即不能再用。1.3.3沙黃水溶液：將沙黃飽和酒精溶液用蒸餾水稀釋10倍即成。此液保存期以不超過4 個月為宜。1.3.4石炭酸復紅染色液：取3%復紅酒精溶液10mL，加入5%石炭酸水

17、溶液90mL混合過 濾即成。135稀釋石炭酸復紅染色液：將石炭酸復紅染色液以蒸餾水稀釋10倍即成。1.3.6 95% 乙醇41.4藥敏試紙包括強力霉素、頭孢噻肟、阿米卡星、羧芐青霉素、四環素、環丙沙星、諾氟沙星、 新霉素、頭孢氨芐、復方新諾明、頭孢曲松、恩諾沙星、林可霉素、卡那霉素、氨芐西 林、頭孢唑林、青霉素G、慶大霉素。1.5其它常用器材生化反應管（購自杭州天和微生物制劑有限公司，用于純化菌株的生化試驗）沙門氏 菌診斷血清（購自中國生物科技集團公司蘭州生物研究所），16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit （購自TaKaRa公司），無菌超凈臺，37

18、C培養箱，微量移液器，酒 精燈、剪刀、酒精棉球、鑷子、珀爾環、玻片、培養皿等。試驗方法2.1染色鏡檢2.1.1細菌抹片的制備組織臟器材料可先用鑷子夾持中部，然后以滅菌或潔凈剪刀去一小塊，夾出后將其 新鮮切面在玻片上壓印（觸片）或涂抹成一薄層，自然干燥。將干燥好的抹片，抹片向 上，以其背面在酒精燈外焰上如鐘擺樣來回拖過數次，略作加熱（但不能太熱，以不燙 手為度）進行固定。2.1.2革蘭氏染色在已經干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結晶紫溶液，經12min，水洗。加革 蘭氏碘液于抹片上媒染，作用13min，水洗。加95%酒精于抹片上脫色，約0.51min， 水洗。加稀釋的石炭酸復紅（或沙黃溶液）復染

19、1030s，水洗。吸干或自然干燥，鏡 檢。革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。2.2細菌的分離培養在超凈工作臺上取病料分別接種于麥康凱培養基平皿和營養瓊脂培養基平皿上，在 兩平皿上分別畫出三個區間并標記。首先用燒灼滅菌的手術刀燒灼肝臟表面，然后用手 術刀在燒灼處切開組織，用滅菌的接種環在切開組織內挑取部分組織，劃線接種麥康凱 培養基平皿第一區間，然后再以同樣的方法把其他兩個區間劃完。待兩平皿劃線完畢后， 在平皿底上作好菌名、日期和接種者等標記，將培養基平皿倒置在37C恒溫箱培養24h。2.3細菌純化按上述要求做的細菌分離培養，若在所有接種的平板培養基上均有細菌生長。平板 上長出細小、圓形

20、，形似針尖的粘液型菌落，特點是表面光滑、濕潤、透明、邊緣整齊。 在麥康凱瓊脂平板上長出無色的菌落，則為疑似菌落。取初步分離的細菌，按常規作平 板劃線純化培養，挑選典型菌落，作進一步培養，供生化及其他鑒定用。2.4生化試驗2.4.1糖發酵試驗細菌的24h純培養物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、 衛茅醇生化反應管內，膠帶封口，開口朝下，置容器中，37C培養24h后觀察結果。2.4.2硫化氫試驗取雞白痢沙門氏菌得出培養物，接種于硫化氫微量發酵管中，37 C培養24h，觀察 結果（培養液呈黑色沉淀者為陽性，以“ + ”表示；無變色者為陰性，以“-”表示）。2.5藥敏試驗取雞白痢

21、沙門氏菌，用滅菌接種環致密劃線于普通LB瓊脂表面。用無菌鑷子將各種 抗菌藥物圓紙片，分別貼于培養基表面，各片距離要相等，37 C培養24h觀察結果（根 據藥敏紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小來判斷該菌對各種藥物的敏感程度）。2.6玻板凝集試驗先用接種環挑取分離菌株純培養物少許與A-F群多價O混勻，2min后觀察結果。如 果出現明顯的凝集現象為陽性反應。為了對分離菌株進一步分群和定型，我們采用沙門 氏菌屬的O9O1O12單因子血清和H抗原分別與分離的菌株用平板凝集反應的方法作凝集 試驗。用生理鹽水和大腸桿菌分別作陰性對照比較。2.716s rDNA細菌鑒定PCR試劑盒進行PCR定2.7.1模板DN

22、A的提取挑取單個沙門氏菌菌落于16s-free水，混勻，與100C沸水中10min，室溫冷卻， 8000rpm 10min。將上清移入另一個干凈的指形管里冏。2.7.2PCR反應反應體系為:模板 DNA50-100四g TOC o 1-5 h z PCR Premix25pLForward prime0.5pLReverse Primer0.5pL16s-free %Oup to 50四L反應條件94 C5min94 C1min54 C1min卜30 Cycles72 C1.5min ,72 C5min1%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產物切膠回收，并用TA克隆，測序結果31細菌分離和形態特征分離菌在

23、普通營養瓊脂上呈圓形、微隆起、光滑、濕潤、半透明或灰白色、邊緣整 齊，直徑小于1mm的針尖大小“露珠狀”小菌落；在麥康凱瓊脂上長出無色透明圓形 小菌落。病料直接涂片，革蘭氏染色之后，油鏡下觀察，可發現少量革蘭氏陰性小直桿 菌；挑取菌落涂片，染色后鏡檢，可發現大量短小、兩端鈍圓、多數單個存在的革蘭氏 陰性小桿菌（見圖1）。圖1雞白痢沙門氏菌革蘭氏染色鏡檢3.2生化試驗取分離菌進行生化試驗，結果能分解葡萄糖、甘露醇，但產酸不產氣；不能分解 乳糖、麥芽糖、蔗糖、衛茅醇；阿拉伯糖能產酸產氣；h2s試驗無變色為陰性。符合雞 白痢沙門氏菌的生化特征（見表1）。.表1生化試驗結果葡乳麥甘蔗H2S阿拉伯糖衛茅

24、醇+-+-注：+表示產酸不產氣；-表示不分解；產酸產氣3.3藥敏試驗藥敏試驗結果表明此菌株對卡那霉素、恩諾沙星、環丙沙星等敏感；對頭孢噻肟、 氨芐西林等中介；對羧芐青霉素、頭孢氨芐等耐藥（見表2）。表2藥敏試驗結果藥物種類藥物名稱紙片含量（曜）判定抑菌圈直徑（mm）標準抑菌圈直徑（mm）敏感度耐藥中介敏感青霉素類青霉素G10U1510耐藥羧芐青霉素1001713耐藥氨芐西林101716中介頭孫塞肟302321中介頭孢頭孢氨芐30180耐藥菌素頭孢曲松102819耐藥類頭孢唑琳301822敏感阿米卡星301720敏感氨基新霉素301723敏感糖苷慶大霉素12067-91012敏感類卡那霉素301

25、818敏感四環四環素30190耐藥素類強力霉素30160耐藥恩諾沙星101213-161720敏感哇諾諾氟沙星101213-161720敏感酮類環內沙星52125敏感3.4血清型鑒定純培養菌株與沙門氏菌A-F多價血清進行玻片凝集反應，結果均發生凝集反應，為 陽性。進一步用單因子血清與之反應結果均與09和O1 2因子發生凝集反應，H抗原不凝集。 用生理鹽水和大腸桿菌分別作對照比較，不出現凝集現象，排除了細菌的自凝和非特異 性凝集現象。3.516s DNA細菌鑒定PCR試劑盒進行PCR鑒定3.5.11%的瓊脂糖凝膠電泳結果樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外凝膠成像系統下觀察，在約526bp處出現一

26、特 異性條帶，并且與陽性對照的大小相近，500bp圖2 1%的瓊脂糖凝膠電泳圖片Lane M： 100bp ladder； Lane 1：待檢樣品；Lane 2：陽性對照；Lane 3：陰性對照。3.6.216s DNA的序列為：AGGGCGATGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGAGTTTGATCATGGCTCAGAT TGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGCAGC TTGCTGCTTTGCTGACGAGTGGC

27、GGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTGGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGA CCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAG CTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGC

28、GTGTATG AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCCGCCGCGTAAATTCGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGAATCACTAGTGAAT TCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT GTTTCCTGTGTGAA

29、ATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGA AGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTA ATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGC通過該序列BLAST搜索比對，結果表明所分離菌株的16s DNA與雞白痢沙門氏菌高 度同源。小結與討論4.1通過臨床癥狀觀察、病理剖檢初步診斷為雞白痢沙門氏菌病，繼而進行涂片染色鏡 檢、生化試驗、血清學試驗及16s DNA確

30、診為雞白痢沙門氏菌病。4.2藥敏試驗結果表明在選用藥物時應選用卡那霉素、恩諾沙星、環丙沙星等幾種對細 菌敏感的藥物，迅速達到治療的目的，提高成活率，增加經濟效益。測定細菌對抗菌藥 物的敏感性，不僅可用于禽病傳染病的治療性診斷，而且是為選擇具有有效的藥物進行 治療提供依據，這對防治禽病減少藥物浪費具有重要意義9。在養雞中應盡量減少藥物 的使用量，一是可降低飼養成本，二是藥物攝入量過多，將破壞腸道的正常菌群使雞白 痢沙門氏菌的耐藥性增加，一旦發病更難治愈。所以在正確診斷疾病的基礎上合理用藥， 顯得尤為重要。同一種藥物不要長期的使用，不得隨意加量或減量，用藥一定要用夠 療程（一般是37d）不要隨意縮短或延長用藥時間。有條件的可做藥敏試驗，選療效 好針對性強的藥使用，還可選用一些生物競爭抑制劑（如促菌生）和中藥制劑（如生物 調理素）進行治療，療效好且