1、丹皮酚的提取分離及結構鑒定 18/18丹皮(dn p)酚的提取(tq)分離(fnl)及結構鑒定摘要:丹皮酚是牡丹皮和徐長卿的主要活性成分，在醫藥、香料、化工領域具有廣泛用途，其藥理活性廣泛: 鎮靜、鎮痛、催眠、解熱、抗炎、抗過敏，免疫調節等，提取丹皮酚的方法主要有有機溶劑浸出法、水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法等。本報告主要就丹皮酚的研究狀況等作了介紹，實驗采取水蒸氣蒸餾法從牡丹皮中提取丹皮酚。并用薄層色譜法，紫外分光光度法等對丹皮酚進行了結構鑒定。關鍵字：丹皮酚 水蒸氣蒸餾法 薄層色譜法文獻綜述1 前言丹皮酚( paeonol, 簡稱Pae) , 又稱牡丹酚, 主要是從蘿摩科植物徐長卿干燥根或

2、全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹、芍藥的根皮中提取分離出來的一種活性成分, 其成分單一、純度高、質量控制良好、藥理作用明確、毒副反應小，而且臨床使用安全。 是一種小分子的酚類化合物, 化學式為，2-羥基-4-甲氧基-苯乙酮，呈白色針狀結晶, 具有鎮靜、鎮痛、解熱、解痙、抗炎等作用, 并具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、改善微循環、保護缺血組織、抗菌和抑制皮膚色素合成等作用。近年來還發現丹皮酚具有抗腫瘤作用, 同時能提高機體免疫力且無明顯副作用。2.研究進展丹皮始載于本經, 具有清熱涼血, 活血化瘀的功效, 為歷版中華人民共和國藥典收載品種,.其主要有效成分為丹皮酚。藥理活性廣泛、高效、低毒，在心腦血管

3、系統疾病和腫瘤防治等方面具有廣闊的開發前景和臨床應用價值。目前市場上對丹皮酚的需求量較大，除用于醫藥制劑原料外，還廣泛用作牙膏及護發、護膚、美容等日化產品的原材料。對于丹皮酚的研究，早在1964，Doifode等就合成了-溴代的丹皮酚。Rehman等合成了丹皮酚5-位的鹵化衍生物，并且發現均具有較好的抗真菌性。 1995年，徐鳴夏等合成了乙酰水楊酸丹皮酚酯，即2-（乙酰氧基）苯甲酸-2-乙酰基-5-甲氧基苯酯，其藥理作用與乙酰水楊酸酯類藥物相似，但抗血栓形成作用較強，適用于防治心腦血管栓塞性疾病。潘顯道陽對合成得到的5個丹皮酚酯類化合物通過MTT法進行體外抗腫瘤藥理活性的評價，初步篩選結果顯示

4、：5-硝基-2-呋喃甲酸的丹皮酚酯的抑制腫瘤細胞活性與臨床上常用的抗癌藥物5一氟尿嘧啶(5-Fu)的活性相近，對人腫瘤細胞有一定抑制作用，其細胞毒活性可能與該化合物分子具有的氧化特征有關。今年(jnnin)來，對于丹皮酚的制備方法，定量分析，藥理作用和結構修飾方面(fngmin)都有許多進展。2.1 丹皮(dn p)酚的提取方法 牡丹皮中丹皮酚的提取方法：蒸餾法，溶劑浸取法，其中，熱浸取法明顯優于冷浸取法。酸水乙醇，堿水乙醇提取法優于醇提取法。經酸堿水解提取液中丹皮酚量升高可能由于酸堿增加了丹皮酚中原苷和次級苷的水解，游離出更多的丹皮酚。徐長卿中丹皮酚的提取方法：蒸餾法，有機溶劑浸取法，直接蒸

5、餾，大孔樹脂法，超臨界流體萃取法等。人工合成丹皮酚：由于從天然藥物中提取費用高，自然條件限制大，時間長，所以，人工合成很廣泛，均以間苯二酚為起始原料，但具體工藝流程，工藝條件，收率有所不同，部分方法收率可達55%，且純度高。2.2丹皮酚的主要分析方法2.2.1HPLC法：是測定中藥成分的主要方法，方便，快捷，準確盛習鋒等用該法測定了不同產地丹皮藥材中丹皮酚和去甲丹皮酚的量.2.2.2氣相色譜法：凌婭等用直接(zhji)蒸餾毛細管氣相色譜法，以正十五烷為內標物對康潰丸中的丹皮(dn p)酚進行了內標比對定量(dngling)研究。2.2.3薄層掃描法：該法簡單易行，測定結果穩定，重現性好，準確可

6、靠尤其在中藥復方制劑中，可較好的排除其他成分的干擾，葉鳳等用該法測定了血脂平膠囊中丹皮酚的量，劉義海等用薄層掃描法測定了知地黃丸中丹皮酚的量。2.2.4毛細管電泳法：趙新鋒等選用蘆丁為內標用膠束電動毛細管色譜法分離牡丹皮及中藥六味地黃丸中丹皮酚的量。以丹皮酚對照品峰面積與內標的比值對其濃度作圖，得標準曲線，線性關系良好且加樣回收率高，簡單，快捷，經濟高效.2.2.5化學發光法：丹皮酚含有酚羥基，具有還原性。汪寶其等選用魯米諾-過氧化氫-鈷離子為空白發光體系利用光氧化氫對丹皮酚結構中酚羥基的氧化作用，而消耗發光體系中的過氧化氫，致使原空白發光體系的發光強度降低，即淬滅，淬滅程度的強弱在一定范圍內

7、與丹皮酚的濃度呈線性關系進而，對丹皮酚進行測定。2.2.6 分光光度法應用分光光度法測定丹皮酚含量的技術較為成熟，按不同的原理又可分為以下幾種方法：1）紫外分光光度法：具有操作簡單、費用較低等優點。但由于該法基本上沒有分離能力，樣品處理要求嚴格，故常被用于要求不很嚴格的一般測定、中藥材炮制方法與處理條件比較、制劑工藝選擇等方面 。胡錫波等以紫外分光光度法測定了丹皮酚包合物中丹皮酚的含量，結果顯示丹皮酚質量濃度在1241025 IxgmL范圍內與吸光度線性關系良好(r=0999 6)。2）一階導數分光光度法：王煥云等 用水蒸氣蒸餾法提取丹皮酚得樣品溶液，分別對樣品溶液、對照品溶液及陰性對照品溶液

8、在210360 nm波長范圍內繪制吸收光譜及一階導數光譜圖。從一階導數光譜可知，選擇263 llm和267 nm兩波長以峰零法定量效果較好。以A=A： 一A： 為縱坐標、質量濃度為橫坐標，丹皮酚質量濃度線性范圍是30188048 IxgmL，回收率為10195 。結果表明，此法可不經分離對丹皮酚進行含量測定，且結果準確。3）正交函數(hnsh)分光光度法：王煥云等用水蒸氣蒸餾法提取麥味地黃丸得供試品溶液(rngy)，以水為空白，在220350 nm波長范圍內分別(fnbi)對丹皮酚對照品、供試品和陰性對照品溶液進行掃描，得吸收光譜。根據光譜信息，選用二次正交多項式系數(P2)作為定量參數，以消

9、除陰性對照的干擾，在26382838 nlTl波長之間每間隔4 nm測定各個波長的吸收度值，按公式P2：(+5)A1+ (一1)A2+(一4)A3+(一4)A4+(一1)A5+(+5)A6計算P2值。結果P2與質量濃度C呈良好的線性關系，平均回收率為990。3.丹皮酚的藥理作用31 改善心腦血管作用311 抗心律失常多年來國內外學者對丹皮酚抗心律失常作用及其機制進行了深入研究，發現Pae有明顯對抗大鼠心肌缺血再灌注模型心律失常作用，80 mgkg 160 mg kg Pae，能使大鼠室顫(VF)及室性心動過速(VT)的發生率降低，并可有效地縮短持續時間，縮小心肌缺血和梗死的范圍，拮抗心肌損傷。

10、近來研究發現，丹皮酚的抗心律失常作用與其對鈣離子通道的阻滯作用具有重要的內在聯系 。 312 抗動脈粥樣硬化動脈粥樣硬化(Athero sclersis，AS)是當今嚴重威脅人類健康的疾病之一，是許多心腦血管疾病的病理基礎，尋找有效對抗AS的藥物成為近年來研究的熱點之一。經兔、鵪鶉、大鼠等多種動物實驗發現，Pae具有明顯的抗AS作用。75 mgkg、150 mgkg Pae 可明顯降低兔動脈粥樣硬化模型血清中總膽固醇 (TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平，延緩動脈粥樣硬化進程，顯著降低兔主動脈斑塊面積、內膜，中膜厚度比及內膜泡沫細胞數。病理學觀察顯示，丹皮酚可不同程度地減輕主動脈的病變。313

11、 改善(gishn)血流變心腦血管血栓性疾病的發生和發展過程中，除血小板聚集活性增高外，常伴隨(bn su)著血液流變學性質的異常，特別是與血液粘度、紅細胞壓積、紅細胞聚集性的升高和紅細胞變形性降低等因素有關。Pae對血液流變學指標具有(jyu)多方面的影響。100 mgkg 丹皮酚能顯著降低切率條件下的全血粘度，并顯著降低紅細胞壓積、紅細胞聚集指數、最大變形時間及血小板粘附率。紅細胞初始表觀變形指數和最大表觀變形指數與對照組相比明顯增大。3.1.4 抗心肌梗死作用丹皮酚能明顯減少冠脈結扎致實驗性心肌梗死犬的心肌梗死面積、降低心肌梗死程度、減少心肌酶的釋放，同時可提高模型犬血清中SOD 的活力

12、， 增強清除自由基能力， 降低血清中MDA 的含量， 減輕脂質過氧化損傷的程度。其作用機制可能是通過穩定細胞膜，抑制缺血心肌的膜損傷，清除自由基，降低脂質過氧化等發揮作用。3.1.5 抗腦缺血再灌注性損傷的作用武繼彪等10采用大鼠大腦動脈栓塞模型，觀察缺血再灌注24h 后，大鼠神經功能癥狀評分、腦梗死體積測定、病理組織學變化以及腦組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和過氧化氫酶（CAT）的含量，結果顯示丹皮酚干預后大鼠神經功能癥狀評分提高，腦梗死體積縮小，腦缺血再灌注損傷腦組織的病理改變減輕，SOD、GSH-Px、CAT 的活性升高，MDA 含

13、量減少，提示丹皮酚保護缺血腦組織的作用機理可能與抗自由基損傷有關。32 抗腫瘤作用 研究顯示，丹皮酚在體內外對人白血病細胞K562、人乳腺癌基因細胞T6-17、肝癌細胞BEL-7404、移植性肝癌細胞HepA、人白血病腫瘤細胞株K562 ADM、宮頸癌細胞系HeLa、人大腸癌細胞株HT一29等多種腫瘤細胞具有增殖抑制作用。與大多數抗腫瘤藥物作用特點相同，丹皮酚對不同腫瘤細胞株的增殖表現出不同的抑制作用。Pae抗腫瘤作用不僅體現在直接抑制腫瘤細胞的生長，還表現在逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用和對多種化療藥物的增敏作用及協同作用。33 增強(zngqing)免疫力作用Pae不僅通過調節某些免疫學指標(

14、zhbio)來發揮抗腫瘤效應，而且還具有提高正常機體免疫系統功能的作用。據文獻5報道(bodo)，與對照組比較，754mgkg， 377 mgkg、189 mgkg Pae組的小鼠脾臟指數分別增加283 、613 、151 ，胸腺指數分別增加674 、791 、349 ，淋巴細胞轉化率分別增加314 、576 9，6、209 。可見，Pae對小鼠免疫功能具有明顯的增強作用。通過觀察小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能、血清溶血素的形成和二硝基氯苯 (DNCB)致小鼠遲發型變態反應(Delayed cutaneous hypersensitivity，DcH)，發現丹皮酚能提高小鼠巨噬細胞的吞噬功能，使小

15、鼠血清溶血素明顯高于對照組，同時可增強DNCB導致的皮膚遲發型變態反應，說明 Pae對小鼠特異性體液免疫功能、特異性細胞免疫功能以及非特異性免疫功能均有增強作用。34 鎮痛、消炎作用王憲齡等運用熱板法和扭體法對牡丹皮的鎮痛作用進行了研究，發現牡丹皮的高、中、低劑量組均表現出一定的鎮痛作用，能延長小鼠疼痛潛伏期，減少醋酸所致小鼠扭體反應次數。其中以高劑量組作用最強。牡丹皮水煎劑能抑制炎癥組織的通透性和前列腺素(PG)的生物合成，從而對多種急性炎癥反應具有抑制作用，并且它不抑制特異性抗體的產生，不影響補體旁路途經的溶血活性，故在發揮抗炎作用的同時不影響正常的體液免疫功能。湯文璐等先用角叉菜膠誘導形

16、成大鼠急性足爪腫脹模型、用二甲苯誘導形成小鼠耳片水腫模型、用福氏完全佐劑(CFA)誘導形成大鼠佐劑性關節炎模型，然后用丹皮總苷(TGM)進行灌胃給藥抗炎治療。發現TGM 對上述幾種炎癥均有明顯的抑制作用。此外，丹皮酚還有護肝、保護腎缺血再灌注損傷、降血糖等眾多藥理作用。3.5 抑菌作用(y jn zu yn)早期研究發現(fxin)丹皮酚在體外l15 000 濃度(nngd)下對大腸桿菌、枯草桿菌有明顯抑制作用，在體外12 000 濃度下對金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，對流感病毒及常見致病性皮膚真菌亦有抑制作用。高健等，通過瓊脂擴散抑菌試驗證明，丹皮酚及其衍生物對受試的白色念珠菌、金黃色葡萄球

17、菌、短小芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌4 種革蘭氏陰性菌、陽性菌皆有明顯的抑制作用。4丹皮酚的結構及理化性質化學名: 2-羥基-4-甲氧基-苯乙酮化學式丹皮酚的物理性質：丹皮酚為白色或微黃色有光澤的針狀結晶，無色針狀結晶（乙醇），熔點49-51，氣味特殊，味微辣，易溶于乙醇和甲醇中，溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿及二硫化碳中，稍溶于水，在熱水中溶解，不溶于冷水，能隨水蒸汽揮發。丹皮酚可隨水蒸氣蒸餾，且在紫外光區有強烈吸收，在274nm波長處E（1% 1cm）為862，利用此性質可用紫外分光光度計進行測定。5丹皮酚的鑒別 (1) 取本品約5mg，加乙醇(y chn)1ml溶解(rngji)后，加重(jizh

18、ng)氮苯磺酸試液0.5ml，搖勻，加碳酸氫鈉試液1滴，漸顯橙紅色。(2)取本品加乙醇溶解，制成每1ml中約含5g的溶液，照分光光度法（中國藥典2000年版二部附錄A）測定，在314nm和274nm的波長處有最大吸收，在295nm和244nm的波長處有最小吸收。（3）在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時間應與丹皮酚對照品峰的保留時間一致。(4)本品的紅外光吸收圖譜應與對照的圖譜(光譜集46圖)一致6.含量測定照氣相色譜法(中國藥典2000年版第二部附錄 E)測定。色譜條件與系統適用性試驗 以聚乙二醇(PEG)-20M為固定相，涂布濃度為10；柱溫為200。理論板數按丹皮酚峰計算應不

19、低于2000，丹皮酚峰與內標物質峰的分離度應符合要求。校正因子測定 取聯苯適量，加石油醚(6090)制成每lml含0.5mg的溶液，作為內標溶液。另取丹皮酚對照品約50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中；精密加入內標溶液50ml，搖勻，取2l注入氣相色譜儀，按峰面積計算校正因子。測定法 取本品50mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中；精密加入內標溶液50ml，搖勻，吸取21，注入氣相色譜儀，測定，計算，即得。7.丹皮酚的應用7.1 丹皮酚在醫藥中的應用藥理實驗已經證明丹皮酚具有消炎抗菌1、解熱鎮痛、降壓利尿、抗凝血、抗變態性反應、抗癌、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化、抑制腫瘤、促進微循環、增強免疫功能等作用

20、。以丹皮酚單體為主料做成的膠囊劑、注射劑、口服液、顆粒劑、酊劑，外用性軟膏劑、膜劑、片劑、凝膠劑、磷脂復合體等已廣泛用于臨床應用。如5徐長卿注射荊朋于治療風濕痛、胃痛、及其他諸痛；丹皮酚注射劑及丹皮酚的親水性軟膏和吸水性軟膏用于治療皮膚瘙瘁、過敏性皮炎，濕疹等；丹皮酚口腔藥膜具有直接通過口腔粘膜吸收起效特點；以丹皮酚為主料的消腫貼膏能有效抑制急性炎癥和亞急性炎癥反應。隨著人們對丹皮酚藥理活性的深入研究，丹皮酚還將擴大在，心血管、中樞神經系統疾病等方面的應用。7.2 丹皮(dn p)酚在化妝品中的應用(yngyng)丹皮(dn p)酚是一種天然無毒的日化添加劑，它能抑制細胞內氧自由基的產生，具有

21、使皮膚增白，將皮膚沉積色素還原退色，消淤化斑等作用。如含丹皮酚的特效美容霜和駐顏面膜用于促進面部皮膚血液循環、活化衰老的表皮細胞、消除皺紋、去斑等作用；以其為主要成分做成的護發去屑香波和健美發膠具有保溫護發、促進頭發增生、止瘁等作用。此外，丹皮酚還廣泛用于婦女、嬰兒衛生用品、食品添加劑、保健茶品、飼料添加劑中。二、實驗方案設計1.實驗目的（1） 掌握用水蒸汽蒸餾法提取丹皮酚的方法；（2）學會用薄層色譜法鑒別丹皮酚； 2.實驗意義 水蒸汽蒸餾, 可以直接獲取丹皮酚晶體, 提取物純度較高, 尤其是水蒸汽蒸餾法成本低, 且不需要特殊儀器。在鑒定丹皮酚時用薄層色譜法，簡單，易行，重現性好，可靠性高，在

22、對丹皮酚的提取中水蒸氣蒸餾和薄層色譜法都具有重要意義。3.實驗原理丹皮酚提取原理：水蒸氣蒸餾法是指先蒸餾提取揮發性成分、將藥渣再加水提取的方法，適用于含揮發性成分藥材的提取，但其提取率遠低于醇提法 。水蒸氣蒸餾法又可以分為直接水蒸氣蒸餾法、堿溶液浸泡一水蒸氣蒸餾法、酸溶液浸泡一水蒸氣蒸餾法、鹽溶液浸泡一水蒸氣蒸餾法。研究發現，加鹽蒸餾法是丹皮酚提取的最優方法 。為了提高其在水中溶解度，通常采用有機溶劑、助溶劑、表面(biomin)活性劑等途徑。在蒸餾過程中可以加鹽、先加堿后加酸等提高提取率。提取過程中，適宜pH范圍的選擇以及確保溶液(rngy)貯存過程中的穩定性是關鍵。 丹皮(dn p)酚的鑒

23、定原理：薄層掃描法簡便易行，測定結果穩定，重現性好，準確可靠，尤其在中藥復方制劑中可較好地排除其他成分的干擾。白少巖等應用反射法鋸齒掃描法測定了牡丹皮中丹皮酚含量，以環己烷一氯仿一無水乙醇(7：3：1)為展開劑，將待測溶液在013 mm硅膠G板展開，波長A =274 nm 和An=365 am下進行掃描，結果均較理想，證明薄層掃描法操作簡便、省樣、省時，不失為理想方法4.實驗流程圖 牡丹皮飲片（150g） 粉碎 牡丹皮細粉1500mL水，40gNaCl,15mL95%乙醇,40浸泡1h 浸泡好的牡丹皮共水蒸餾 餾出液靜置析晶，過濾 丹皮酚粗品 濾液 40mL無水乙醇溶解 溶液 200mL水，靜

24、置析晶 結晶液 過濾(gul) 丹皮(dn p)酚純品 濾液(ly) 5.實驗步驟5.1提取分離方法： 稱取150g牡丹皮，用粉碎機粉碎，將粉碎好的牡丹皮細粉放入1000燒杯中，加入1500mL水，15mL95%乙醇，40gNaCl,于40的熱水中浸泡； 浸泡40min后，取850mL藥材進行水蒸氣蒸餾，剩余藥材繼續浸泡； 2h后將剩余的650mL藥材加入圓底燒瓶進行蒸餾； 收集所有餾出液，放置析晶，有白色針狀結晶析出，濾取結晶，合并所有結晶產物，得丹皮酚粗品； 將粗品置于500mL燒杯中，加入40mL無水乙醇溶解，待溶解完全后加入200mL水，放置析晶； 待乙醇揮發完全后，過濾，收集所有結晶

25、，得丹皮酚純品。注意事項: 若在制取過程中得不到白色結晶,只有油珠狀物質沉出,可在蒸餾液中加入少量晶種,摩擦甁壁后,既有較大量的丹皮酚結晶析出.也可用乙醚萃取蒸餾液幾次,合并萃取液后,加無水硫酸鈉脫水,回收乙醚至少量,放置析晶,抽濾, 結晶用少量水洗23 次,置于干燥器中干燥。5.2結構鑒定 （1）定性鑒別1.測熔點：取少量純品，在顯微熔點測定儀測熔點，熔點49-512.顯色反應：取本品約5mg，加乙醇1ml溶解后，加重氮苯磺酸試液0.5ml，搖勻，加碳酸氫鈉試液1滴，漸顯橙紅色三氯化鐵反應 取產品結晶少許，滴加5%三氯化鐵醇溶液,呈暗紫色。 與濃硝酸(xio sun)反應 取產品結晶(jij

26、ng)少許,滴加濃硝酸(xio sun)數滴,呈紅棕色（2）結構鑒定3.紫外分光光度法：取本品加乙醇溶解，制成每1ml中約含5g的溶液，照分光光度法（中國藥典2000年版二部附錄A）測定，在314nm和274nm的波長處有最大吸收，在295nm和244nm的波長處有最小吸收。4.薄層色譜法：取本品粉末1g，加乙醚10ml，密塞，振搖10min，濾過，濾液揮干。殘渣加丙酮2ml使溶解，作為供試品，另取丹皮酚對照品，加丙酮酸制成每1ml含2mg的溶液。作為對照品溶液。照薄層色譜法，吸取上述溶液各10微升，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（4：1：0.1）為展開劑，展開，取出，曬干，噴以2%香草醛硫酸乙醇（110）在105加熱至斑點顯清晰，供試品色譜中，與對照品色譜相應的位置，顯相同顏色的斑點。6.實驗儀器與試劑6.1實驗試劑，見下表：序號名稱數量規格195%乙醇溶液25ml500ml瓶 AR2氯化鈉固體40.3克分析純3氯仿10ml500ml瓶 AR4無水乙醇43ml500ml瓶 AR5乙醚20ml500ml瓶 AR6純凈水1500ml18L/桶7硅膠G30g500g瓶 薄層層析8丙酮酸10ml500ml瓶 AR 92%香草醛硫酸乙醇-500ml瓶 AR 10乙酸乙酯10ml500ml瓶 AR11冰醋酸1