1、 邱寧巖第五章 體外分析技術1體外分析技術 1.體外放射性分析技術 (in vitro radioassay) 放射性竟爭結合分析 *放射免疫分析(RIA) (competitive radioactive binding assay) 放射性非競爭結合分析 *免疫放射分析(IRMA) (non-competitive radioactive binding assay) 2.體外非放射性標記免疫分析技術 化學發光免疫分析 時間分辨熒光免疫分析 酶免疫分析 2體外免疫分析技術的示意圖固相支持物表面待測物包被抗體標記抗體競爭法非競爭法標記抗原3第一節 放射免疫分析的基本原理 (radioimmu

2、noassay, RIA) 諾貝爾醫學獎獲得者 Yalow博士。1959年 Yalow和 Berson兩位博士在研究胰島素的抗體時發展起來的。最早建立的是INS的RIA法。RIA法是一種高特異性、高靈敏度的微量檢測技術。American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, for the development of radioimmunoassays of peptide hormones. 4一、放射免疫分

3、析的基本原理 放射免疫分析法是利用限量的特異抗體與標記抗原和非標記抗原的競爭結合反應，通過測定放射性復合物的量來計算出非標記抗原量的一種超微量分析技術。 American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, for the development of radioimmunoassays of peptide hormones. 5*Ag+Ab*AgAb+*Ag+(B)(F)（標準或待測樣品)AgAgAb+Ag

4、 當Ag=0時；當Ag不斷增加時。(限量抗體）占總T的30-50%6Ag+* Ag+Ab* AgAb +AgAb +free*Ag+放射免疫分析的基本原理示意圖7放射免疫分析（RIA）的特點：1.*Ag和Ag與Ab有相同的親和力2. *Ag和Ab為恒量時，*Ag和Ag的總 量大于Ab上的有效結合位點。3. Ag的量與*AgAb 的量成反比， 而與游離的*Ag成正比。8建立標準曲線目的：利用標準曲線來推算出病人樣品（Ag）的含量。配制一系列的標準品濃度：（0、20、40、80、160和320ng/L） 0ng/L 20ng/L 40ng/L 80ng/L 160ng/L 320ng/L通過測定*

5、AgAb或*Ag的量可建立標準曲線。 1B。234569B/T100%F/T 100%B/F 100%標 準 曲 線 的 縱 坐 標-結 合 率（B/B+F、F/B+F、B/F、B/B。 100%）標 準 曲 線 的 橫 坐 標-標 準 品 濃 度10二、 放射免疫分析的基本條件特異性抗體、標記抗原、標準品、分離技術、放射性測量儀器 1、特異性抗體 高親和力、高特異性、高滴度的抗體。11（1）高親和力的抗體： 親和力（Affinity)是指抗原和抗體之間的一種結合能力。親和力的測定方法是： Scatchard作圖， 以AgAb的濃度為橫坐標，以B/F為縱坐標繪制直線，觀察直線的斜率（-KA）

6、。標準曲線的斜率越大，表明抗體親和力越高，抗原抗體的結合也越緊。12抗體親和力的Scatchard作圖13（2）高特異性的抗體： 抗體的特異性(Specificity)指：抗體分別與相應的抗原和抗原結構類似物的結合能力的比較。 一般用交叉反應(Cross Reaction)來表示，交叉反應越小，抗體的特異性越高。反之，抗體的特異性就差。14抗CGMP抗體的交叉反應圖15（3）高滴度的抗體： 抗體滴度(Titer)指抗體實際應用時的稀釋倍數。 稀釋倍數越大，抗體的滴度越高，滴度一般要求在1/1000以上為好。滴度曲線的目的：確定抗體稀釋度；找出抗原和抗體的最適比例（B/T為50%時的抗體稀釋度）

7、。 看一看抗體滴度曲線16抗體滴度曲線172、標記抗原: 1)比放射性活度高而適當；比放射性活度并不是越高越好 比放射性活度：是指每微克抗原上標記放射性核素的千貝可KBq/ug. 被測抗原濃度高-比活性 被測抗原濃度低-比活性 1Bq=1/S 1Ci=3.7 10Bq2)保持標記抗原的免疫活性：每個蛋白質分子上標記1-2個碘原子。183)便于放射性測量： 125I標記的抗原有r射線能直接測量4)放射化學純度高：放射化學純度: 是指具有免疫活性的標記抗原占總放射性的百分數。 放化純度要求大于90%以上5)半衰期適當：125I半衰期60天、131I半衰期8天、3H半衰期12.5年193. 標準品

8、標準品是用來制備標準曲線用的。標準品抗原的要求：（1）高純度的抗原（2）化學結構、免疫活性與待測抗原一致204. 分離技術 1）雙抗體法：*Ag+Ab1= *AgAb 1+ Ab2=*AgAb1Ab2+ *Ag + Ag = AgAb 1+ Ab2=AgAb1Ab2 + Ag 優點：特異性強、非特異本底低。 缺點：反應時間長。212）沉淀法（聚乙二醇法）：加入30%的PEG，通過吸水作用使蛋白質脫水，致r球蛋白（B）沉淀優點：能快速分離；缺點：非特異本底高。3） 吸附分離法（活性炭吸附法）：吸附（F）的部分（分子量小），離心后使F沉淀，B懸浮在溶液中。測定溶液部分的放射性計數。優點：能快速分離

9、； 缺點：非特異本底高。 224）雙抗體沉淀法（PR試劑法）：雙抗法+PEG法的結合，融合了兩種方法優點。第二抗體和PEG的用量都減少優點：能快速分離、特異性高、非特異本底低。是目前最好的方法之一。5）固相分離法: 試管固相法： 優點：操作簡便 缺點：抗體吸附量小。微球法和微粒法： 優點：操作簡便 、 抗體吸附量大。磁性顆粒法： 優點：操作簡便 、快速、 抗體吸附量大23 5.放射性測量儀器： 根據不同的放射性核素選擇不同的放射性測量儀器。 125I選用-計數器進行測量。 3H選用液體閃爍計數器。24 RIA基本操作步驟示意圖1.加待測樣品或標準品2.標記抗原4. 37溫育，使反應達到平衡5.

10、加B與F分離劑6.放射性計數器檢測3.加特異性抗體25 單探頭手動r-計數器26 單探頭便攜式手動r-計數器272829303132 （三）RIA的質量控制 質量控制:就是利用一些客觀的指標，經常對分析質量進行檢查，遇有質量異常則及時采取對策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍。質量控制的目的：保證實驗分析誤差控制在可接受的范圍。判斷試劑盒質量和方法學的穩定性。331.實驗室內部質量控制：零標準管結合率（ Bo %）非特異結合率（NSB%）最低和最高濃度管之差標準曲線直線回歸參數ED25、ED50、ED75質控圖341）零標準管結合率（ Bo %）：最大結合率Bo%指：Ag=0時，*Ag與Ab的

11、最大結合率。最大結合率不是越高越好，最大結合率過高（80-90%）可能影響RIA的靈敏度。有時為了提高靈敏度把最高結合率調到30-50%，以提高靈敏度。352）非特異性結合（NSB%）：當Ab=0時，*Ag與非特異性物質的結合率。一般應小于5-10%。NSB越低越好。NSB的高低可以反應B與F分離技術的好壞。如：雙抗法的NSB低；PEG法的NSB高。363） ED25、ED50、ED75：指B/B。 100%（結合率）=25%、50%、75%時，橫坐標上所對應的濃度值。主要用來反應標準曲線的穩定性;曲線向右漂移ED值升高。曲線向左漂移ED值降低。見圖試劑盒穩定、實驗操作正確則每次的ED值，應在

12、一定范圍波動。如波動異常，表明標準品變質或用量有誤。37用ED25、ED50、ED75值判斷 曲 線 的 漂 移 情 況CEA的標準曲線384）標準曲線直線回歸參數標準曲線的主要質控指標：截距a、斜率b和相關系數r要求a、b值穩定，r0.99392.評價RIA試劑盒質量的指標精密度準確性靈敏度特異性穩定性健全性401） 精密度 (Precision) 是指同一樣品重復測定的實測值的離散程度。離散程度越小，表明分析系統的精密度越高。常以變異系數（CV）表示。 CV%(變異系數）=標準差（S）/平均數100%（1）精密度圖：用以判斷分析系統復管的變異情況(CV)應7% 通常都是兩側的變異系數大，特

13、別是低劑量區。見圖41T4的RIA精密度圖縱 坐 標 復 管CV%、 (CV 應 7% )橫 坐 標 T4 的 濃度（KIU/L）422）靈敏度 （Sensitivity) 就是指統計上能與零劑量相區別的最小量。一般指測定方法的最小可檢出量。既B。90%所對應的值。3）準確度(Accuracy) 是指樣品的測定值偏離真值的程度。（1）回收率：回收率越接近100%說明該方法準確度較好。 回收率=測定值/真實值100%433.實驗室外部質量控制按照一定的評價方案和方法，對各實驗室的實驗項目進行分析比較。提高各實驗室之間結果的可信性和可比性。44 第二節：免疫放射分析 （Immunoradiomet

14、ric Assay, IRMA） IRMA是1968年提出的，它是RIA的一種變種。 一. 基本原理 免疫放射分析法是利用過量的標記抗體與非標記抗原形成復合物，用免疫吸附劑除去多余的游離的抗體，發現復合物的放射性與非標記抗原的量呈正相關。 Ag + *Ab = Ag-*Ab + *Ab （過量） （B） （F）45 二.基本方法（一）雙抗體夾心法Ab1(過量）+Ag Ab1Ag +*Ab2Ab1Ag*Ab2+*Ab2 （二）標記第三抗體法 Ab1（過量） +Ag Ab1Ag +Ab2 Ab1AgAb2 + *Ab3 Ab1AgAb2 *Ab3 + *Ab3 （三）雙標記抗體法（四）IRMA-生

15、物素-抗生物素蛋白測定系統46雙抗體夾心法IRMA示意圖47標記第三抗體法48三、免疫放射分析法的特點： (Immunoradiometric Assay) 1.反應動力學：非競爭性抗原抗體結合反應。Ag-*Ab復合物的量與非標記抗原的量呈正相關。2.靈敏度：靈敏度高出RIA10倍。特別在低劑量區。3.特異性4.穩定性5.標準曲線的工作范圍6.缺點：抗原必須有兩個以上的抗原決定簇。49放免法與免疫放射法的比較RIAIRMA標記物抗原抗體結合劑的量（Ab） 限量過量結合反應式 競爭性非競爭性 靈敏度較低較高(10倍）NSB對低劑量區的影響 較低較高50第四節 非放射性標記免疫分析 放射性和非放射

16、性標記免疫分析的異同：相同點：基本原理相同（利用AgAb進行的免疫結合反應）反應類型相同（競爭性或非競爭性的分析方法）不同點：標記物不同：一種是放射性的標記物；另一種是酶、化學發光物、鑭系元素。測量的信號不同：一種是放射性的計數;另一種是光信號測量儀器也不同：一種是r-計數器；另一種是發光儀51一、化學發光免疫分析技術化學發光免疫分析技術 魯米諾、異魯米諾和吖啶脂化學發光酶免疫分析技術 堿性磷酸酶電化學發光免疫分析技術 三聯吡啶釕（Ru(bpy)3）2+52（一）化學發光免疫分析技術（chemiluminescence immunoassay)1.基本原理： 利用能產生化學發光的化合物標記抗原

17、或抗體，建立競爭性或非競爭性的免疫分析法。化學發光物經適當處理后能發生化學反應，同時以光子形式釋放出能量。最后通過測定化學發光物發光的強弱來推算出待測抗原的量。532.常用的化學發光標記物：魯米諾、異魯米諾和吖啶脂等吖啶脂的特點是：分子量小；可以直接標記抗原和抗體；發光標記物很穩定（有效期可達一年左右）543.化學發光免疫分析的反應式：Ag + Ab吖啶脂（過量）= Ag-Ab吖啶脂+Ab吖啶脂然后利用分離技術，分離B與F。在Ag-Ab吖啶脂中加入H2O2和鹼性溶液（PH11以上）。即可迅速發光，然后進行測量分析。見圖55甲基氮蒽-吖啶脂標記抗體的 化學發光免疫分析流程圖。56 吖啶酯化學發光

18、系統CH3C=OORN+OH-H+H2O2+ H2O+ROH光子 + CO2 +CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO57閃光與輝光及其測量方式的差別時間發光信號輝光坪區速率法測量原位進樣積分法測量閃光尖峰584.化學發光免疫測定的優缺點：優點： (1)直接標記的化學發光。 (2)對溫度和PH的變化相對不敏感。缺點：（1）發光時間集中在加入H2O2 和鹼性溶液后的短時間內。 （2）試劑和儀器的成本較高。59ACS:180 SE6061Allergy TestingNot available in USA62ADVIA Centaur Methods Thyr

19、oid FunctionTSHTSH-3rd Gen.T4Free T4T3Free T3T-UptakeAnti-TPOAnti-TGFertilityTotal hCGLHFSHProlactinEstradiol-6Estradiol II-6TestosteroneProgesteroneOncologyAFPCEAPSAcPSAfPSA*CA125IICA19-9CA 15-3BR 27.29HER-2/neuCardiacCKMBTroponin I - UltraMyoglobinHomocysteineBNP AnemiaB12FolateRBC FolateFerritinA

20、llergyTotal lgE225 sIgEs,mixesScreensTher. Drug MonitorDigoxinDigitoxinTobramycinCarbamazepinePhenobarbitalGentamicin PhenytoinVancomycinTheophyllineValproic acid*Cyclosporine - 2006Infectious DiseaseRubella lgG Rubella lgMToxoplasma lgGToxoplasma lgMHBsAgHBsAg ConfirmatoryAnti-HBsHBc IgMHBc TotalHC

21、V HIV 1/0/2HAV IgM HBeAg*HAV Total Anti-HBe*Adrenal Serum CortisolUrine CortisolMetabolicInsulinC-Peptide (S/U)Intact PTH*in developmentAssay developed, manufactured, and sold by Bayer HealthCare for Ortho-Clinical Diagnostics, Inc.Autoimmune*ANA 200665 Immunoassays63（二）化學發光酶免疫分析技術 (chemiluminescenc

22、e enzyme immunoassay,CLEIA）1.基本原理： 利用堿性磷酸酶標記抗原或抗體，建立競爭性或非競爭性的免疫分析法，反應完加入底物（金剛烷），最后酶促底物發光，通過測定發光的強弱，來推算出待測抗原的量。 642.化學發光酶免疫分析（CLEIA）的標記物： 堿性磷酸酶（AKP） 3.化學發光酶免疫分析的特點： 以堿性磷酸酶（AKP）為標記物來標記抗原或抗體。 以金剛烷作為發光底物。654.底物金剛烷的發光機制665.化學發光酶免疫分析的優缺點：優點：（1）全自動化檢測。 （2）靈敏度高、精確性好。 （3）藥盒有效期長。缺點：（1）儀器和樣品的成本較高。 （2）新項目的研制開發較

23、慢。6768697071（三）電化學發光免疫分析技術 （electrochemiluminescence,ECLIA） 電化學發光免疫測定：是電化學發光（ECL）和免疫測定相結合的產物。 ECL和CL 的差別：ECL:是電啟動發光，發光分子可反復利用，可控發光CL:是化合物簡單的混合啟動的發光，發光分子只能利用一次。瞬間發光721.電化學發光免疫分析的原理：Ag + Ab1釕 + Ab2生物素=釕Ab1AgAb2生物素 + 親和素磁粒 = 釕Ab1AgAb2生-親磁粒 + Ab1釕 + Ab2生物素 釕Ab1AgAb2生-親-磁粒被吸附到電極表面后，當給電極施加電壓時，釕標記的化合物和TPA（三丙胺）發生反應，導致發光。一但撤去電壓，釕標記的化合物和TPA仍保持穩定。732. 電化學發光的發光劑：標記物是：三聯吡啶釕（Ru(bpy)3）2+電子供體是：三丙胺（TPA）74三聯吡啶釕（Ru(bpy)3）2+75測量池76ECL 的測量池電極電極工作電極磁鐵光電倍增管TPATPATPATPA773.電化學發光的特點： 發光可以精確控制，靈活性強。 生物素-親和素間接包被，可大大提高方法的靈敏度。 檢測范圍寬。如：HCG（0-1000IU/ML） 靈敏度高。7879樣本盤型樣本架型Elecsys1010Elecsys2010E17080Elecsys 1010側