1、2016年分子診斷微流控技術分析報告（此文檔為word格式，可任意修改編輯！）2016年2月正文目錄1、分子診斷概述42、分子診斷技術原理421、核酸提取方法422、核酸分子雜交技術523、核酸擴增技術5231、常規 PCR 5232、定量PCR技術6（1）熒光染料7（2）熒光探針7233、等溫核酸擴增技術83、生物芯片931微陣列芯片1032微流控芯片104、國內外POCT化的分子診斷產品1341、Cepheid 的 GeneXpert 1342、Nanospere 的 Verigene 系統 1443、卡優迪生物科技的Mini8 1444、 北京博奧生物的RTisochip-A核酸分析儀1

2、55、國內重點公司分析1651、利德曼1652、博暉創新176、發展風險分析181、分子診斷概述分子診斷是采用分子生物學的理論和技術，通過直接探查核 酸的存在狀態或缺陷，從核酸結構、復制、轉錄或翻譯水平分析 核酸的功能，從而對人體狀態與疾病做出診斷的方法。它檢測的 基因有內源性（即機體自身的基因）和外源性（如病毒、細菌等） 兩種，前者用于診斷基因有無病變，后者用于診斷有無病原體感 染。回顧分子診斷學20余年的發展歷史，大致經歷3個階段：1）利用核酸分子雜交技術進行遺傳病的基因診斷；2）利用以定量PCR為代表的核酸擴增技術，檢測存在于宿 主的多種DNA和RNA病原體，及多基因遺傳病細胞中 mRN

3、A的表達量；3）以生物芯片技術為代表的高通量密集型檢測技術，分析 過程自動化、分析速度提高，實現高通量、大規模的快速檢測病 原體和疾病組織中的突變序列。PCR產品占據目前分子診斷的主要市場，生物芯片是分子 診斷市場發展的主要趨勢。2、分子診斷技術原理分子診斷的主要技術有核酸提取方法、核酸分子雜交、核酸 擴增技術。21、核酸提取方法傳統的DNA提取方法是一般先破碎細胞，用含少量異戊 醇的氯仿除去蛋白質，而核酸保留在水相中，加入RNA酶去除 RNA，最后用異丙醇、乙醇把DNA從提取液中沉淀出來。而磁珠法核酸提取，通過超順磁性氧化硅納米磁珠與核酸分 子特異性地識別和高效結合，在Chaotropic鹽

4、（鹽酸胍、異硫 氰酸胍等）和外加磁場的作用下，能將核酸從血液、動物組織、 食品、病原微生物等樣本中分離出來。相比傳統的核酸提取方法， 磁珠法核酸提取具有自動化、高通量、操作簡單、用時短、安全 無毒、提取的核酸純度高等特點。22、核酸分子雜交技術具有一定互補序列的核昔酸單鏈在液相或固相中按堿基互 補配對原則締合成異質雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的 雙方是待測核酸序列和探針序列，通過檢測核酸探針序列上的標 記物，來反映待測核酸序列的含量。探針的標記需要高靈敏性、 不影響堿基配對的特異性、不影響探針分子的主要理化性質、對 酶促反應活性無影響、檢測方法具有高靈敏性和特異性。標記方 法包括32P、

5、35S和3H等核素標記物及生物素、熒光素或者化 學放光探針等非核素標記物。核酸分子雜交技術包括固液雜交和液相雜交，固液雜交則包 含膜上印記雜染(Southern和Northern)和原位雜交；液相雜 交則包括RNA酶保護分析法及核酸酶S1保護分析法等。23、核酸擴增技術核酸擴增是一大類技術方法的總稱，目前包括常規PCR、 實時熒光定量PCR和等溫核酸擴增技術等。231、常規 PCR聚合酶鏈反應(即 polymerase chain reaction，PCR)原理：PCR 是模板DNA、引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下發生酶促聚合反應，擴增出所需目的DNA。包括 三

6、個基本步驟：雙鏈DNA模板加熱（90-96C ）變性成單鏈（變性 Denature）；在低溫（50C左右）下引物與單鏈DNA互補配對（退火 Annealing）; 在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模 板 DNA 延伸 Elongation o由這三個基本步驟組成一輪循環，理論上每一輪循環將使目 的DNA擴增一倍，這些經合成產生的DNA又可作為下一輪 循環的模板，所以經25-35輪循環就可使DNA擴增達106倍。232、定量PCR技術實時定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基 團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環 變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣

7、品中的DNA或 者cDNA的起始濃度進行定量的方法，實時熒光定量PCR是 目前確定樣品中DNA或cDNA拷貝數最敏感、最準確的方 法。對實時定量PCR標記的熒光基團包含有以SYBR染料為代 表的非特異性熒光標記（僅與DNA雙鏈結合）、以及以Taqman 探針為代表的特異性熒光標記（利用熒光能量共振轉移fret 技術來進行檢測）。（1）熒光染料在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒 光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻 入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒 光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈 DNA進行結合，可以通過溶

8、解曲線確定PCR反應是否特異。（2）熒光探針將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完 成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反 應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光 素游離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數 的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測 與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因 的拷貝數。實時定量PCR技術無需雜交檢測，可以實時檢測結果，加 快了檢測的速度，只需要1-2小時的時間就能得到檢測結果。 但在進行多種病原體檢測的時候，

9、需要向同一體系中加入多種病 原體的特異性引物，由于不同PCR引物擴增效率、反應體系不 同等問題，定量PCR非常難以應用于多重檢測。233、等溫核酸擴增技術恒溫擴增技術是繼PCR技術后發展起來的一門新型的體外 核酸擴增技術，擴增反應的全過程（除初始的雜交步驟外）均在 單一溫度，無需專門的擴增儀器下進行。目前主要的恒溫擴增技 術有：滾環核酸擴增、環介導等溫擴增、鏈替代擴增、依賴核酸 序列擴增和解鏈酶擴增。它們都具有共同的特點：恒溫、高效、 特異、不需要特殊的儀器設備。其中依賴核酸序列擴增與環介 導等溫擴增是相對穩定的技術，應用較多。3、生物芯片生物芯片技術是近年發展起來的分子生物學與微電子技術 相

10、結合的核酸分析檢測技術，是運用分子生物學、基因信息、分 析化學等原理進行設計，以硅晶圓、玻璃或高分子為基材，配合 微機電自動化或其他精密加工技術，所制作的高科技元件，具有 快速、精確、低成本之生物分析檢驗能力。生物芯片樣品處理能 力強、用途廣泛、自動化程度高等特點，具有廣闊的應用前景和 商業價值，是分子診斷領域的一大熱點。生物芯片根據原理不 同，可分為微陣列芯片(Microarrays)和微流控芯片(Microfluidic chip)兩類。31微陣列芯片最初的生物芯片技術主要目標是用于DNA序列測定、基 因表達譜鑒定和基因突變體檢測和分析，所以又稱為DNA微 陣列或基因芯片技術。微陣列芯片的

11、作用原理是在固相支持物上 原位合成寡核昔酸或者直接將大量探針以顯微打印的方式有序 地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交的檢 測分析，得出樣品的遺傳信息。微陣列芯片在數平方厘米之面 積上布放數千或數萬個核酸探針，檢體中的DNA、cDNA、RNA 等與探針結合后，借由熒光或電流等方式偵測，一次測驗即可提 供大量基因序列相關信息，具有快速、精確、低成本之生物分 析檢驗能力。32微流控芯片現階段，生物芯片已經朝著一個高度自動化、集成化的方向 發展，核心理念就是建立一個“芯片上的實驗室(Lab-on-a-chip)， 微流控技術的發展使得這個理念得到實現。微流控芯片是指通過 微電子機械系

12、統(Micro-electro-mechanical Systems，MEMS)技術在 固體芯片表面構建微型生物化學分析單元和系統，以實現對無機 離子、有機物質、蛋白質、核酸以及其他生化組分的準確、快速 和大信息量的檢測。在微流控技術用于核酸診斷的應用過程中，將核酸提取、擴 增及檢測過程等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米大小的芯 片上，并以微通道網絡貫穿各個實驗環節，從而實現對整個實驗 系統的靈活操控，承載核酸診斷的各項功能。微流控芯片技術將 核酸診斷過程全面整合，只需加入樣本即可，大大簡化了檢測過 程的操作難度，排除了不同操作者實驗技能的影響，并解決了外 源核酸對檢測結果的干擾問題。圖表7：

13、微流控芯片是一個完整的微型實驗室微流控芯片樣品體積只需幾微升，加熱器直接集成在芯片 上，與傳統的PCR相比，在相同擴增效率下，芯片的熱循環效率快2-10倍。同時連續流動式PCR、熱對流驅動PCR等技術 的使用，使得擴增過程加快，現有的微流控芯片能夠將診斷檢測 過程縮短至最低10-15分鐘。圖表8：微流控芯片PCR技術微流控芯片中具有很多微管道，可對不同的反應室進行隔 離。微流控芯片中不同反應互不干擾，從而具有多重檢測的功能， 可同時檢測多個樣本，或同一樣本的不同指標。由此，通過在微 流控芯片中設置多個反應室，最多可同時進行數十個檢測，實現 高通量檢測。圖表9:微流控可實現多重檢測微流控芯片所使

14、用的材質為玻璃、硅片、聚合物等，成本不 高；制作方法包括光刻、蝕刻、模塑法、注塑法、激光燒蝕法等， 制作工藝也較為成熟；對液體流動過程的控制也有電動流控制、 數字化微流控、壓力驅動流體控制、被動毛細力流體控制等多種 控制方式。微流控芯片的生產具有較為成熟的工藝，已經被用于 電化學血氣分析、心肌標志物免疫檢測、病原體核酸診斷等多個 方面。圖表10：微流控芯片可作為合適的POCT產品由以上所知，微流控芯片滿足了 POCT在檢測性能、易用 性、成本上的各種需求，簡化了操作步驟，顯著提高檢測效率， 是核酸診斷POCT化的重要發展方向。4、國內外POCT化的分子診斷產品41、Cepheid 的 Gene

15、XpertGeneXpert PCR儀包含微流樣品管、超聲裝置、注射裝置、 旋轉裝置、直角光路設計的特殊定量PCR反應管等幾個部分， 從樣品制備到完成測試最快僅需30分鐘左右，大大縮減了樣品 的制備時間。PCR儀具有四種不同的型號，分別具有1、2、4、 16個獨立的反應模塊，每個反應模塊均具有獨立的光學以及熱 學校準，可以隨時分別開始反應；一臺電腦可同時連接6臺 PCR儀，靈活性強，極大滿足了實驗室對檢測量的需求，同時 也降低了成本。相應的試劑盒Xpert MRSA則是將酶、dNTPs、緩沖液等全 部濃縮在一個微珠(Bead)中，而基因特異性引物、熒光探針、內 參則包含于另一個微珠中。檢測時，

16、只需將兩個微珠加入卡盒中,GeneXpert PCR儀就可以自動完成樣品測試，大大減輕了操作人 員的工作強度。獨特的微珠試劑設計一方面可保持樣品和試劑在 常溫下的穩定性，以及在微流樣品管中的快速溶解，另一方面也 便于精確操作減少誤差，使得同一反應在任何時候任何地點都可 以得到高度一致的檢測結果。圖表11： GeneXpertPCR儀及試劑盒Cepheid公司的試劑利用定量PCR的方法來檢測，無需雜 交，整體速度很快。在進行多種病原體檢測的時候，單個卡盒很 難進行多重檢測，但可以同時使用多個卡盒，通量的問題得以解 決，但成本過高。42、Nanospere 的 Verigene 系統Verigen

17、e系統可自動完成提取核酸、雜交、并通過銀染染色 將雜交信號放大，之后得到定量的分析數據。Nanosphere使用 直徑13-20nm的帶有寡核昔酸修飾的納米微球，使用納米微球 比普通的熒光微球具有更好的靈敏度。甚至可以不需要進行 PCR，僅通過信號擴增就能完成檢測。Verigene系統將反應器 和讀數器分開，檢測的方便性較GeneXpert弱，同時需要有雜交的步驟，反應時間也較慢，但Verigene系統的卡盒可適用于多 重檢測，為檢測帶來了方便性。圖表12： Nanosphere的Verigene卡條及儀器43、卡優迪生物科技的Mini8卡尤迪生物科技是中國首家專注研發手持型通用熒光定量 PC

18、R儀的生物公司，其首創的“一鍵式一步法Mini8實時熒光 定量PCR檢測系統”，簡化了核酸的提取步驟，重量僅21kg， 可使用12V直流電源，適合車載移動使用，最快10-15分鐘得 到結果。2015年為非洲埃博拉疫情,Mini8實時熒光定量PCR檢 測系統被列入WHO官方名錄，成為中國首家入選的核酸檢測 設備供應商。另外公司仍在利用Utah大學的Extreme PCR技術，開發 僅需10多秒就能得到檢測結果的新一代產品。圖表13:卡優迪Mini8實時熒光定量PCR檢測系統44、北京博奧生物的RTisochip-A核酸分析儀2015年4月20日，CFDA批準博奧生物集團有限公司的 恒溫擴增微 流

19、控芯片核酸分析儀RTisochip-A醫療器械注冊。博奧生物利用環介導等溫擴增（LAMP）技術，無需90C以 上的高溫變性過程，特異性更高，反應更快，最快20分鐘出結 果；微流控碟式芯片上的24個檢測通道，避免不同反應池的交 叉污染，可以進行多指標的并行檢測；每個樣品反應量僅需14 皿，節省反應試劑，非常符合快速診斷的需求。為了充分滿足客 戶對不同檢測樣品數和指標數的需求，博奧生物提供1*24、 2*11、3*8三種不同型號的碟式芯片。5、國內重點公司分析51、利德曼北京利德曼（300289）將與英國ENIGMA DIAGNOSTICS LIMITED （以下簡稱“Enigma”）合作共同設立

20、合資公司，成為 Enigma的獨家合資伙伴，向中國市場交付Enigma Mini Laboratory床邊分子診斷系統。Enigma將向該合資企業轉授權其技術和知識產權，使之能 為中國市場開發相關的分子檢測、其他產品和儀器，并能在中國境內制造生產。Enigma公司成立于2004年，系一家設立并 注冊于英格蘭和威爾士的公司，專注于分子診斷設備、檢測及其 他產品，擁有 Defence Science Technology Laboratory 授予的一系 列專利的獨家許可以及美國應用生物系統公司和Celera Licences 的實時PCR設備推廣的許可，并致力于研發和商業化項目。Enigma M

21、L系統提供了將現有分子診斷的前處理、PCR檢 測、數據處理和分析、數據傳輸合為一體的全自動化解決方案， 將反應所需的全部試劑預裝入一次性卡架內進行操作，免去了之 前PCR產品費時費力的樣本核酸提取和其它操作過程。此產品 利用實時定量PCR的方法進行檢測，將獨有的直接加熱技術應 用于PCR擴增過程中，即保留了定量PCR快速的特點，又利 用特有的實時PCR反應體系實現單管一次性多指標檢測。Enigma ML系統的測試數據可安全上傳至云端服務器，可 集中進行流行病學調查數據處理，同時在醫院臨檢系統可以實現 檢測結果的實時傳輸和遠程診療。52、博暉創新博暉創新（300318）于2007年4月與美國Kionix公司成 立合資公司博昂尼克，獲得了 Kionix公司“層狀微流體結構與制造方法