1、實驗五 1.酶聯免疫吸附實驗ELISA)2.補體結合反響1.酶聯免疫吸附實驗ELISA)免疫標志技術定義： 將抗原-抗體反響與標志技術相結合，用放射性同位素、酶或熒光素標志的知抗體或抗原，經過檢測標志物，間接測定未知的抗原或抗體。分類：放射免疫測定法：131I，32P免疫熒光技術：FITC，PE免疫酶測定法：HRP，AP免疫酶測定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA)用酶標志的抗原或抗體進展的抗原抗體反響。 辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點：高度特異性：堅持抗原抗體反響的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg程度微量檢測定性定量檢測：反響液顏色深淺或光密度值分

2、類：酶聯免疫吸附實驗：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法： 組織中或細胞外表的抗原。酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)用酶標志抗原或抗體檢測液體血液、細胞液中未知抗體或抗原的方法。1.定義2.分類間接法Indirect ELISA：將知抗原吸附于固相載體，酶標志二抗檢測液相中未知抗體雙抗體夾心法Sandwich ELISA)：將知抗體吸附于固相載體，酶標志一抗檢測液相中的可溶性抗原競爭法Competitive ELISA) ：將知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標志抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-Lin

3、ked ImmunoSorbent Assay,ELISA)3. 原理以間接性ELISA為例：顯色實驗內容： 間接法測定溶血素 定性檢測實驗資料脫纖維綿羊紅細胞 抗原兔抗綿羊紅細胞抗體溶血素 待測兔血清HRP標志羊抗兔IgG 二抗包被緩沖液：0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物緩沖液： pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：OPD 10mg，底物緩沖液25ml，30% H2O2 40L酶標板，酶標儀實驗方法1.抗原的處置：脫纖維綿羊血加3mL N.S，混勻2000rpm，5min加3mL N.S，混勻2000rpm，5mi

4、n取2mL壓積紅細胞參與2mL蒸餾水，震蕩破碎紅細胞用包被緩沖液稀釋成1：400備用2.包被抗原：取酶標板，參與100L/孔的抗原稀釋液4，濕盒內，18h取出包被好抗原的酶標板4孔/組，甩干孔內液體以洗滌液200L/孔洗滌3次，3min/次3.加待測血清標志各孔，參與相應液體100L/孔1234陰性空白陽性待測4.加二抗：37，濕盒內，30min甩干孔內液體以洗滌液200L/孔洗滌3次，3min/次各孔參與酶標二抗100L/孔37，濕盒內，30min5.顯色：甩干孔內液體以洗滌液200L/孔洗滌3次，3min/次參與底物溶液100L/孔避光顯色，10min6.察看結果實驗方法預期結果陽性：顯色

5、為黃色陰性：無色1 2 3 4陰性陰性陽性陽性本卷須知洗滌徹底，防止交叉污染。按順序加樣，孔底無氣泡。包被和溫育在濕盒內進展。2.補體結合反響Complement fixation Test, CFT概念： 補體結合反響： 是指在補體的參與下，以綿羊紅細胞SRBC和溶血素抗SRBC的抗體作為指示系統的抗原抗體反響。補反中包括兩個系統五種成分：待檢系統：知Ag或Ab、待檢Ab或Ag及僅供一組Ag-Ab系統反響的定量補體。指示系統：綿羊紅細胞和溶血素。原理：待測系統抗原+未知血清1 2補體12Step 1 抗原抗體復合物的構成Step 2補體的結合和耗竭指示系統SRBC+抗SRBC抗體Step 3SRBC的裂解121：No Ab； 2：AbAg待測血清 Ab陽性No Ab陰性AgAgAg抗原：傷寒菌裂解產物待測血清：56，30min補體：豚鼠血清2%綿羊紅細胞溶血素資料：方法：12345實驗管血清對看管抗原對看管補體對看管SRBC對看管待測血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原補體 N.S搖勻，37，水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 搖勻，37，水浴15min1份/2人預期結果：1管內液體混濁呈淺紅色為不溶血