1、 試驗(yàn)三 不同營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件對(duì)淀粉酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的影響第二模塊 產(chǎn)淀粉酶微生物的篩選和選育一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)液體搖瓶培養(yǎng)技術(shù)；了解不同營(yíng)養(yǎng)成份和培養(yǎng)條件對(duì)微生物生長(zhǎng)及酶活力的影響。二、實(shí)驗(yàn)原理微生物的培養(yǎng)/發(fā)酵方式：二、實(shí)驗(yàn)原理微生物的培養(yǎng)條件：1、營(yíng)養(yǎng)條件：碳源、氮源；2、溫度；3、pH；4、氧氣；5、滲透壓等。問(wèn)題：1、如何分析微生物的最適培養(yǎng)條件？2、產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌的生長(zhǎng)條件和產(chǎn)酶條件是否一致？二、實(shí)驗(yàn)原理單因子變量法確定微生物的最適培養(yǎng)條件：不同pH值配方1：淀粉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去離子水 1000mL，pH 4.0配方2：淀粉 3

2、g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去離子水 1000mL，pH 7.2不同碳源配方3：羧甲基纖維素鈉 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去離子水 1000mL，pH 7.2配方4：葡萄糖 3g，蛋白胨 10g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O， 1.5g，去離子水 1000mL，pH 7.2不同氮源配方5：硝酸鈉 10g，淀粉 3g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1.5g，去離子水 1000mL，pH 7.2配方6：硫酸銨 10g，淀粉 3g，K2HPO4 1.5g，MgSO47H2O 1

3、.5g，去離子水 1000mL，pH 7.2二、實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶兩種。-淀粉酶可隨機(jī)地作用于淀粉中的-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉的粘度降低，因此又稱(chēng)為液化酶。-淀粉酶可從淀粉的非還原性末端進(jìn)行水解，每次水解下一分子麥芽糖，又被稱(chēng)為糖化酶。-淀粉酶液化-淀粉酶糖化糊精、低聚糖葡萄糖淀粉三、實(shí)驗(yàn)材料菌種：實(shí)驗(yàn)二中分離獲得的產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌1株；培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)一中各組分別制備的各種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基；儀器：搖床、分光光度計(jì)。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)發(fā)酵液接種和擴(kuò)培提前24h將平板培養(yǎng)物刮取一環(huán)，在1mL無(wú)菌水中震蕩打散，然后按50uL接種量分別轉(zhuǎn)接

4、如下六種10mL的液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。（每組取一個(gè)菌種，接種6個(gè)不同的培養(yǎng)基）在30、220rpm的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)約24h。1 pH4.02 pH7.23 碳源葡萄糖4 碳源羧甲基纖維素4 氮源硝酸鈉 氮源硫酸銨(二) 菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定將培養(yǎng)24h后液體搖瓶培養(yǎng)物及對(duì)照培養(yǎng)基分別取出0.5mL于試管中，用玻璃移液管加入4.5mL蒸餾水，進(jìn)行10倍稀釋。用對(duì)照培養(yǎng)基分別對(duì)分光光度計(jì)(600nm)進(jìn)行校零。將各稀釋液分別倒入比色杯中，在分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD600)。如果菌液濃度過(guò)大，可繼續(xù)稀釋后再進(jìn)行測(cè)量，保證OD值應(yīng)控制在0.1-1之間。分別記錄各種不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件下

5、OD600值大小，評(píng)價(jià)對(duì)菌體生長(zhǎng)量的影響。(三)不同培養(yǎng)條件對(duì)淀粉酶水解活性的測(cè)定加入試劑實(shí)驗(yàn)管（6）對(duì)照管（6）空白管（1）1的淀粉溶液0.1mL0.1mL-緩沖液0.2mL0.2mL0.2mL搖勻后40恒溫水浴保溫5min相應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)液0.2mL-相應(yīng)對(duì)照培養(yǎng)基-0.2mL-蒸餾水-0.3mL搖勻后40保溫15min乙酸溶液0.5mL0.5mL0.5mL8000轉(zhuǎn)離心5min取0.5mL上清，加入0.5mL稀碘液試管中加4mL蒸餾水稀釋至5mL計(jì)算淀粉酶酶活：顯色后，用空白管于660nm波長(zhǎng)處校零，然后分別測(cè)定對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管的吸光度（A660）。計(jì)算各樣品吸光度大小酶活力。單位酶活（U/mL）的定義為：以1mL粗酶液在40，pH7.0條件下1min反應(yīng)所引起的吸光度值變化0.1為1個(gè)酶活力單位。比較各發(fā)酵菌液酶活力，判斷哪種培養(yǎng)條件下酶活力最高。發(fā)酵液體積反應(yīng)時(shí)間稀釋倍數(shù)0.1A=1單位1、每排負(fù)責(zé)一種培養(yǎng)基的調(diào)零：第一排：pH4.0第二排：pH7.2第三排：碳源葡萄糖第四排：碳源羧甲基纖維素第五排：氮源硝酸鈉第六排：氮源硫酸銨2、單數(shù)組負(fù)責(zé)生長(zhǎng)量測(cè)定的調(diào)零，雙數(shù)組負(fù)責(zé)酶活測(cè)定的調(diào)零。先測(cè)生長(zhǎng)量，再測(cè)酶活，調(diào)零后，確定班上每組同學(xué)都測(cè)定吸光光度值后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)！調(diào)零五、實(shí)驗(yàn)記錄記錄不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)淀粉酶細(xì)菌生長(zhǎng)和酶活的影響，分析該菌最適的培養(yǎng)條件和產(chǎn)淀粉酶條件：培養(yǎng)條件