1、神經系統遺傳病的基因診斷神經系統遺傳病的基因診斷杜萬良北京天壇醫院神經內科基因wDNA上的功能單位。w基因結構模式圖：基因突變wDNA分子結構的化學變化。突變的類型突變的類型w堿基替換：某個堿基被另一個堿基所取代（點突變）。嘌呤或嘧啶之間的取代為轉換；嘌呤與嘧啶之間的取代為顛換。w同義突變：突變后密碼子改變但氨基酸不變化。w錯義突變：突變后氨基酸發生改變。w無義突變：突變后變為終止密碼。w堿基插入和缺失：由于堿基的增多或減少造成閱讀框架的改變移碼突變。以上突變為穩定突變，即傳遞中不再變化的突變。w動態突變：傳遞中不斷發生變化的突變，如三聯體核苷酸數目的變化，一般是由于不等交換所致。突變的一般特

2、性w可逆性 (Aa, aA)w多向性(Aa1, a2, a3, a4)w有害性w稀有性(Human, 10-6)w可重復性(Hot site)遺傳病w由于遺傳物質缺陷或發生改變而導致的機體結構和功能的紊亂。遺傳病的危害w1、發病率逐年上升w2、住院兒童近1/3為遺傳相關疾病w3、自然流產胚胎60%有染色體畸變w4、平均每人攜帶56個有害基因w5、人群中25%患有各類不同程度的遺傳相關疾病w6、絕大多數遺傳病目前沒有理想的治療方法遺傳病的分類遺傳病的分類w染色體病w單基因病w多基因病w線粒體基因病染色體病w染色體病:染色體數目或結構異常。w常染色體病的共同特征：w智力低下、發育遲緩、多發畸形。w

3、性染色體病的共同特征：w性征發育不全或畸形、智力較低。21-三體綜合征w21-三體又稱先天愚型，Down綜合征。w 1866年英國醫生JLH Down首先描述，1959年法國Lejeune證實該病的病因是由于G組染色體多了一條，后確定為21號。w發病率：1/6001/800。w臨床表現：w、特殊面容眼距寬、鼻塌平、口半開、流口水、耳廓小、手足短。w、發育不良、肌張力低、關節松弛、新生兒有第三囟門。w、部分患者有特殊膚紋，如通貫手、atd角達64(正常人41)，w、半數患者伴有先天性心臟病，白血病發病率高于正常20倍。男性基本無生育能力，女性少數可有生育能力。大部分壽命不長，少數可達50歲以上。

4、單基因病w單基因病：染色體上單一基因的一個或兩個等位基因突變。w嚴格按照孟德爾規律遺傳w臨床上最多見。多基因病w多基因?。阂粋€或多個基因與一種或多種環境因素共同作用產生的疾病。w沒有嚴格的孟德爾傳遞規律。w病種少，但患病者多。線粒體遺傳病w線粒體遺傳病是由于mtDNA的突變所導致。w有性生殖的方式決定了線粒體遺傳屬于母系遺傳。（細胞質遺傳）w 1987年首次提出線粒體病概念，目前已經發現100多種疾病與線粒體DNA突變有關線粒體遺傳病線粒體基因組編碼線粒體基因組編碼：2個個rRNA基因和基因和22個個tRNA基因基因13種多肽基因：種多肽基因：核糖體蛋白基因核糖體蛋白基因rps4，rps13，

5、rps14細胞色素細胞色素C氧化酶復合體基因氧化酶復合體基因coxI，coxII，coxIIIATP酶復合體基因酶復合體基因atpA1，atpA2，atpA6，atpA9，atpA10NADH脫氫酶復合體脫氫酶復合體I基因：基因：ND-1，DN-5遺傳病w大多數遺傳病為先天性疾病，但先天性疾病不一定是遺傳病。w大多數遺傳病表現出家族聚集性，但家族性疾病不一定是遺傳病。遺傳病診斷遺傳病診斷w1、病史、癥狀、體征 病史采集、外貌特征、發育狀況。w2、系譜分析 單基因，多基因；顯性，隱性；常染色體，性染色體。 表現度、外顯率、隔代遺傳。 遺傳方式、發病風險。w3、染色體檢查標本外周血、絨毛、羊水、活

6、檢組織。分帶G-, R-, C-, 熒光原為雜交(FISH)分析數目（單體、多體）、結構（易位、缺失、倒位)指征智力障礙、發育畸形、多發流產、不育等。w 4、生化檢查 主要用于分子病和先天性代謝缺陷。 w5、基因診斷 直接診斷被檢者的DNA或RNA。發展最快，前景最好。直接DNA檢測缺失、突變、重排.。間接遺傳標記檢測多態性，連鎖分析。 基因診斷技術：分子雜交、分子擴增、分子測序。傳統的診斷（舉例）：傳統的診斷（舉例）：、問、望、聽、觸經驗型診斷、化驗/檢驗材料：細胞、組織、大分子、小分子、代謝/排泄物等。方法：細胞學、微生物學、生物化學、免疫學、病理學等。、影像學X光、B超、CT、核磁共振、

7、內窺鏡等。、特殊檢查染色體檢查、肌電/心電/腦電、骨密度等。 在醫學發展的過程中，這些方法發揮了巨大作用，隨著技術水平的發展，這些方法也在不斷提高和完善，也還會有其他新的診斷方法的問世。這些診斷有一個無法逾越的鴻溝：預測也就是說“發病”了才能診斷?；蛟\斷wGene Diagnosis：detection of genetic disorders by DNA analysis w直接在DNA或RNA水平上進行結構與功能檢測，從而輔助臨床進行的診斷。w基因診斷是近年來臨床醫學中發展十分迅速的一類嶄新的診斷技術，它依托DNA重組技術，直接從基因型入手，診斷表現型即可以越過產物（酶和蛋白質）直接檢

8、測基因結構而作出診斷。（逆向診斷）w基因診斷始于1978年，Kan第一次成功進行了鐮狀細胞貧血病的產前基因診斷。w基因診斷具有靈敏度高、特異性強、費用低，并對許多疾病特別是遺傳性疾病具有預測性的特點，是一種極具潛力的診斷方法?；蛟\斷的對象基因診斷的對象w1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病w2、單基因遺傳性疾病， 如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥w3、多基因疾病，如腫瘤、高血壓 w4、其它，如親子鑒定、個體識別、法醫物證神經系統遺傳病wWilsons disease (WD)wHuntingtons disease (HD)wCadasilwMelasw(DMD)wCMTwSCAwLeig

9、h基因變異的類型基因變異的類型1、點突變）單個堿基置換）單個堿基的缺失或插入2、片段缺失編碼片段；調節序列3、片段插入編碼片段；調節序列4、重排融合基因5、擴增拷貝大量增加6、動態突變遺傳物質傳遞過程中不等交換使STR重復數增加原理：找突變基礎：PCR（聚合酶鏈反應） DNA DNA以指數形式擴增以指數形式擴增(2(2n n) )，其中長片段以線性形式擴增其中長片段以線性形式擴增 (2(2n+2)n+2)，最終主產物片段長度在兩個引物之間。最終主產物片段長度在兩個引物之間。預變性(92-95C,2-5m)變性(92-95C,30s)復性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)總延伸

10、(72C,7m)(25-35)PCRPCR的一般過程：的一般過程：經過30次的循環, 擴增的DNA片段可達100萬倍以上。2401625611452228200短片段（單鏈）1412108642長片段（單鏈）128643216總片段（單鏈）循環數策略1w直接診斷：直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過PCR擴增產物，以探查基因無突變、缺失等異常及其性質，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病； w間接診斷：當致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時，或致病基因本身尚屬未知時，也可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色

11、體。連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標記通常一起傳給子代，因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代，可以間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態性位點作為標記。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技術均可用于連鎖分析。 遺傳標記遺傳標記1、第一代遺傳標記限制性酶切片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)8kb5kb3kb在個體和群體中，片段長度表現出多態性。如3kb, 5kb, 7kb, 8kbRFLP呈現孟德爾式遺傳。常用檢查方法：核酸雜交；P

12、CR-酶切等。產生多態性的原因是內切酶位點的變化。原位點的消失；新位點的產生。GAATTCCTTAAGGATTTCCTAAAG1 21 21 2III2kb3kb5kb7kb2、第二代遺傳標記微衛星DNA(Micro-satellite DNA) 屬高度重復序列，重復單元26bp，重復區大多幾十幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內，具有較高的多態性。呈現孟德爾式遺傳。目前微衛星DNA已經發現了萬余個位點。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用檢查方法：PCR等。微衛星微衛星

13、DNA PCRDNA PCR擴增結果（示例）：擴增結果（示例）：500bp400bp300bp240bp 該結果顯示在所檢查的人群中，該位點多態性有4種。 微衛星DNA差異最小只相差2個堿基（重復片段只有2個堿基）。2、第三代遺傳標記單核苷酸多態性(SNP) 某些DNA位點上，單個堿基存在著變化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT個體A個體B個體C SNP分布于整個基因組，可在基因內，也可在基因間。估計每1000個b

14、p存在一個。在人類DNA序列變異中，SNP占90%。 單個堿基的插入和缺失不認為是SNP。目前已知基因組中含有150萬個芯片雜交結果示意圖A C G T位點1位點2位點3常用檢查方法：DNA測序、芯片雜交等。常用技術等位基因特異性寡核苷酸雜交（allele-specific oligonucleotide，ASO ） 當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時需要合成兩種或兩種以上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆?/p>

15、致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發生了突變的基因區別開來. PCR可結合ASO，即PCRASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。異常探針 T A G正常人 患者 DNA DNA點雜交正常探針 G A G正常人 患者 DNA DNA點雜交單鏈構象多態性單鏈構象多態性PCR (SSCP-PCR)PCR (SSCP-PCR)DNA分子在電泳中的行為取決于分子量和分子

16、構象。DNA單鏈的構象取決于序列。PCR產物變形后于中性膠中電泳，與正常對照比較，若電泳行為異常，則認為內含突變的堿基。對照對照 實驗實驗等位基因特異性等位基因特異性PCR(Allele-PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)Specific PCR, AS-PCR)利用末端突變的引物進行PCR。實際應用中，常使用三個引物：A35G3553正常上游引物正常下游引物突變上游引物使用正常引物，在正常人有擴增，異常人無擴增。使用突變引物，在異常人有擴增，正常人無擴增。（嚴格條件下的PCR）ACGTATGGTACCGCAT染色體FISH探針整條染色體涂染探針染色體重復序列探針

17、染色體專一位點探針基本過程：1、染色體標本制備2、探針制備3、雜交4、顯微觀察（染色體分帶）整條染色體涂染通過整條染色體涂染判斷易位染色體引物原位標記技術引物原位標記技術(Primed in situ (Primed in situ Labeling, PRINS)Labeling, PRINS) 針對染色體的特異性-衛星DNA 序列設計和合成引物。 利用未標記的寡核苷酸引物與變性后的染色體DNA特異結合, 然后用熒光素標記的脫氧核苷酸(dUTP)與未標記的脫氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下進行延伸反應,標記了的dUTP將以堿基配對的形式摻入到新合成的DNA單鏈中, 最后用相應的熒光抗體與標

18、記物結合以顯示檢測結果。 舉例1wDMDBMD的缺失型診斷：wDMDBMD是一種連鎖隱性遺傳的神經肌肉系統受累的致死性遺傳病。wDMDBMD有70左右為缺失型。w此基因很大，缺失可發生在不同部位，因此應盡可能采用多對引物作PCR擴增（多重PCR）來檢測。如擴增產物電泳后發現有帶紋的缺失，即可作出診斷并對缺失定位。w在進行產前診斷時，一般可先通過檢測家系中有關成員，即確定先證者的缺失區，然后有針對性地作PCR擴增，包括缺失部分的兩端，以判斷胎兒或有關患兒是否也獲得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。 舉例2w脊肌萎縮癥（SMA）w5q13.1 wSMN1,SMN2舉例3wHuntingt

19、ons Disease (HD)wIT15 w（CAG）n舉例4w腓骨肌萎縮癥（CMT）wHereditary motor and sensory neuropathieswa clinically and genetically heterogeneous group of inherited neuropathieswdemyelination (CMT1) waxonal loss (CMT2)wautosomal-dominant, autosomal-recessive, and X-linked inheritance .wmyelin protein zero (MPZ),wea

20、rly growth response gene 2 (EGR2)wperipheral myelin protein 22 (PMP22)wmyotubularin related protein 2 gene (MTMR2)wthe N-myc downstreamregulated gene 1 (NDRG1)wthe L-periaxin gene (PRX)wthe ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 gene (GDAP1)wconnexin 32 gene (GJB1)GJB1 alteration (

21、323TC)GJB1 mutation 323TC舉例5wCADASIL： subcortical ischemic stroke and vascular dementia in human adults.wNotch3 is a large gene composed of 33 exons encoding for a 2321 amino-acids protein.wmutations are highly stereotyped missense mutations,located within the 23 exons encoding for the 34 Epidermal

22、Growth Factor (EGF)-like repeats of the extracellular domain of the Notch3 receptor, all mutations resulting either in a gain or a loss of a cysteine residue.wHigh G-C Content up to 88% (mean G-C content 66%).wIn 65% of the patients, these mutations are clustered within exons 3 and 4 but in the 35%

23、remaining ones, mutations are scattered through the 21 other exons.舉例6wMERRF綜合癥肌陣攣性癲癇和破碎紅纖維病w多系統紊亂，肌陣攣性癲癇，共濟失調，輕度癡呆，耳聾，脊髓退化。w大量團塊狀線粒體聚集于肌細胞中（可被特異性染料染成紅色，破碎紅纖維）。大腦卵圓核與齒狀核有神經元的缺失。w當線粒體中90%存在這種突變，將出現典型癥狀，當突變比例下降時，癥狀也隨之變輕。MTTK*MERRF8344G線粒體突變轉運RNA基因 賴氨酸 疾病縮寫突變位置該位原堿基問題w各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常 。w

24、根據對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法 w如基因缺失可用基因探針雜交，PCR擴增直接檢測；點突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢查。一般無需對家系成員進行分析。但條件是必需知道基因異常的性質，并肯定該異常與疾病之間的關系。w然而，由于許多疾病的遺傳異質性，以及多數遺傳的基因異常尚屬未知，目前能直接診斷的病種雖日益增多，但仍然是比較有限的。 策略2w熱點突變w全基因掃描肝豆狀核變性1. AR 2. 臨床癥狀： 進行性肝硬化，伴有基底神經節豆狀核變性，引起神經癥狀。 3. 病因：存在細胞膜上的與銅轉運有關的ATP7B缺陷導致銅不能從細胞內及時清除而在組織中沉積。 4、基因定

25、位：13q14.3wATP7B gene maps to chromosome 13q14.3, contains 21 exons, and encodes a copper-transporting P-type ATPase. wATP7B mutations are scattered over the entire geneWilsons Disease (WD)Rapid identification of Wilsons disease carriers by denaturing high-performance liquid chromatographyPrev Med 2002 Sep;35(3):278-84Wilsons Disease (WD)Wilsons Disease (WD)W