1、 北京中醫藥大學碩士學位論文紅豆杉組織培養物的成分分析及云南紅豆杉甲素的微生物轉化研究姓名:賈紅婷申請學位級別:碩士專業:中藥學指導教師:閻玉凝20060501摘要摘 要紫杉醇是具有較強抗癌活性的紫杉烷類二萜化合物,主要存在于資源有限、生長緩慢的紅豆杉屬植物的樹皮中,而且含量很低,因而造成了紫杉醇的藥源危機。通過紅豆杉植物細胞培養與微生物轉化進而產生紫杉醇及其衍生物是解決這個問題的可行途徑之一。從紅豆杉細胞培養物中分離得到的大多數成分與天然紅豆杉的化學成分相同或相似,證明了離體培養的細胞具有合成與天然植物一樣的化合物的“全能性”。進行紅豆杉細胞培養,不僅可以得到紫杉醇及其類似物,而且還有可能得

2、到一些新的紫杉烷類化合物,另外還可以進一步明確紫杉醇等化合物生物合成途徑,為今后采用基因工程手段來調控此類化合物的合成打下基礎。微生物轉化是利用微生物代謝過程中產生的酶對外源物質進行結構修飾和改造的催化反應。與化學催化劑相比,微生物轉化具備選擇性高、條件溫和、相對成本低、副產物少、不污染環境等優勢。利用微生物轉化對天然產物進行結構修飾,可得到結構新穎、療效更強的先導化合物,或得到有應用價值的中間體,進而實現工業化。如上所述,本論文對紅豆杉愈傷組織培養物的化學成分進行了分離與鑒定。共得到十個單體化合物,均為類一即.位有含氧取代基團的紫杉烷類化合物。經.、”.、.、.、等光譜技術鑒定這十個化合物為

3、:,一?,;,旺,?,;,一?,;,?,;旺,一一,;一,:另外四個為新化合物,?一,一一?,?;,?一?一,:以及一對異構體和:,?一。一,將從組織培養物中分離得到的云南紅豆杉甲素作為底物,利用株微生物對其進行微生物轉化試驗,結果表明,其中五個菌株對有明顯轉化反應,從中選出反應最明顯的“方”號菌株進行放大生物轉化,得到了選擇性水解轉化產物一 .。關鍵詞:云南紅豆杉甲素;組織培養;微生物轉化;紫杉烷類化合物北京中醫藥大學碩士研究生學位論文, ,. , .,. .,. . ., ., ? , ,. .一,. ,一?,;,一.一,;,一?一,.;一值,一:,?一,一;一,?,; :?,一一,?:,

4、一一?,; :瑾,?,?., , ., , ., ;: ; ;獨創性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知,除了文中特別加以標注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經發表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得北京中醫藥大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。簽名:彰蝗 日期:生:竺蘭:竺關于論文使用授權的說明本人完全了解北京中醫藥大學有關保留、使用學位論文的規定,即:學校有權保留送交論文的復印件,允許論文被查閱和借閱;學校可以公布論文的全部或部分內容,也可以采用影印、

5、縮印或其他復制手段保存論文。保密的論文在解密后應遵守此規定簽名: 導師簽名:閨墨數曰期:.旦:堅原創性及知識產權聲明本碩士論文涉及的課題,從構思、設計、實驗、資料整理及論文撰寫均在導師指導下完成。本論文中涉及的資料、結果等知識產權歸屬中國協和醫科大學藥物研究所所有。在本論文發表以前,知悉者負有保密義務,任何單位及個人不得引用、復制或發表本論文之內容,更不得用于申報專利或成果。實驗過程中曾得到許多同志的指導、幫助和支持,本人均已在論文中提出并致感謝。本論文中所有數據均來自原始實驗記錄,引用資料均以注明,任何數據決無剽竊、篡改、及抄襲之行為。如在本論文的原創性方面出現問題,我愿負法律責任。特此聲明

6、,以此為據。也礎,頤越也導,秕亞 .一鋤銜、挈疑飄鹋蒙彀西案第一章文獻綜述:紫杉醇及其衍生物的研究概況與發展趨勢第一章 文獻綜述紫杉醇及其衍生物的研究概況與發展趨勢紫杉醇,商品名.結構式見 .是紅豆杉中特有的一種二萜類化合物,等人年首次從北美短葉紅豆杉,口.樹皮中分離獲得,為白色結晶粉末、不溶于水,易溶于氯仿、丙酮等有機溶劑,是治療轉移性卵巢癌和乳腺癌的最好藥物之一。然而,由于紅豆杉已在全球處于瀕臨滅絕狀態,其植株生長緩慢,自身的紫杉醇含量又非常低微,靠直接砍伐紅豆杉、從其樹皮和枝干中提取紫杉醇的途徑根本不能滿足臨床需求。. 為此,科學家們開展了對紫杉醇及其衍生物一紫杉烷類化合物資源的研究,并

7、取得了一定進展。一方面,對紅豆杉屬植物進行植物學與細胞工程學的研究,如扦插栽培、雜交育種、組織培養及內寄生真菌的培養等;另一方面,從紅豆杉屬植物及上述植物資源的化學成分入手,分離純化各種紫杉烷類化合物,直接進行藥理活性篩選,或選擇具有特征結構或含量較高的紫杉烷類化合物進行化學半合成,從而得到紫杉醇或比它易溶于水、高效低毒的活性成分;另外還進行了紫杉醇的全合成,雖然已獲成功,但全合成路線復雜,成本昂貴,目前的實際應用價值不大。以下將對紫杉醇的生物活性、生物資源、化學合成、細胞培養、微生物轉化以及生物合成路徑等方面的研究概況進行闡述。.紫杉醇及其衍生物的生物活性紫杉醇是一種高效細胞毒素,具有獨特的

8、抗癌機理。紫杉醇能與微量蛋白結合,促北京中醫藥大學碩士研究生學位論文進其聚合,并抑制其解聚,從而抑制癌細胞的有絲分裂,有效阻止癌細胞的增殖孔。紫杉醇表現出廣譜而高效的抗癌活性,對人的卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、癌、黑色素瘤、肝癌和自血病細胞系等有細胞毒作用。其抗癌活性高于噻唑呋啉、順鉑、依托泊甙、阿霉素和氟尿嘧啶等常用抗癌藥物。目前已發現其他一些天然來源的紫杉烷類化合物也表現出一定的生物活性。許多學.者發現某些紫杉烷類化合物能夠逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥性. 、。例如從東北紅豆杉丁. .樹皮中分離得到、及類紫杉醇化合物、等,它們多數都能促使具有多藥抗性的長春新堿在多藥耐藥人乳腺癌細胞株內聚集,增

9、強耐藥細胞多藥物的敏感性【】。由南方紅豆杉丁. .中分得的、 具有抗肝癌細胞活性【。從云南紅豆杉.、 、.中分得的/、都具有一定的抗胂瘤活性;另外,. .在體外具有抗、和活性嗍。具有抑制從西藏紅豆杉 .中分離出的.不但具有抑制細細胞增殖活性,.、和.胞增殖活性,同時還具有體內抑制白血病細胞活性。意大利學者以來源于西藏紅豆杉的紫杉烷類化合物.為原料合成了一系列抗多藥耐藥腫瘤的衍生物,其中的.已完成臨床前藥理研究,結果表明它能克服因過度表達或其它機制微管蛋白及凋亡調控蛋白表達改變而引起的腫瘤多藥耐藥,對紫杉醇等多種化療耐藥的、荷人癌裸鼠有效。由于其低毒,耐受性強于紫杉醇與紫杉醇的最大耐受量分別為和

10、/,而且其水溶性也較紫杉醇好,可以口服,是一個很有價值的抗腫瘤候選藥物【“。弋。. 第一章文獻綜述:紫衫醇及其衍生物的研究概況與發展趨勢.紫杉醇及其衍生物的生物資源紅豆杉科共有屬種植物,除澳洲紅豆杉屬生長在南半球,其余均產自北半球。紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物,約有個種及幾個變種曲.,我國有種及個變種,中國紅豆杉婦.,西藏紅豆杉 .,云南紅豆杉東北紅豆杉.和南方紅豆杉美麗紅豆杉. .婦. .。研究表明,這些紅豆杉都含有紫杉醇。.紫杉醇及紫杉烷類化合物的化學合成由于紫杉醇的資源有限,而且自身水溶性差,不良反應嚴重等缺點,有機合成已成為擴大其資源,同時尋找更加高效低毒的類紫杉醇化合物的重要手段。年

11、,和小組研究并報道了紫杉醇的全合成【。”,后來又有不少研究涉及到了紫杉醇的全合成,但是目前的情況是全合成路線復雜,成本昂貴,尚無實際應用價值。相對于紫杉酵的全合成,紫杉醇的半合成,更有實際意義。紫杉醇的半合成主要是將紅豆杉植物中的紫杉烷類成分進行結構改造,得到紫杉醇或具有生物活性的紫杉醇衍生物。為中間體的紫杉醇的半合成.詳細敘較為成功的是以述。一廣泛存在于多種紅豆杉屬植物中,具有紫杉烷的母核結構。雖然其活性低于紫杉醇,但它在針葉中的含量相對較高。針葉的數量大且可以再生,所作為紫杉醇半合成的前體是非常適宜的。年,以,以半合成得到紫杉醇,總產率達%?。等成功地從一又。八。耐匆.通過有機合成,還可以

12、得到其他有活性的紫杉醇衍生物。紫杉特爾就為前體是一個成功的范例結構式見 .。研究人員以通過半合成得到了。該化合物具有良好的生物利用度和水溶性,毒副作用低,是迄今為止唯一可與紫杉醇媲美的紫杉烷類抗腫瘤藥物。紫杉醇的抗癌機北京中醫藥大學碩士研究生學位論文理是:能與微量蛋白結合,并促進其聚合,抑制癌細胞的有絲分裂,有效阻止癌細胞的增殖。研究結果表明,在相當毒性劑量下的抗腫瘤作用為紫杉醇的兩倍,其作用機理與紫杉醇完全一樣。體內實驗的結果表明,對所有實驗過的移植腫瘤的毒性均高于紫杉醇。.紅豆杉科紅豆杉屬植物資源拉丁學名 英文名 中文學名歐洲紅豆杉; ;. 短葉紅豆杉; ;缸 加拿大紅豆杉中國紅豆杉?.

13、.東北紅豆杉. 云南紅豆杉. 佛羅里達紅豆杉. 蘇門答臘紅豆杉.加 . 西藏紅豆杉. 墨西哥紅豆杉.雜種紅豆杉. . . 南方紅豆杉. 俗名:美麗紅豆杉. . ?在我國境內有分布第一章文獻綜述:紫杉醇及其衍生物的研究概況與發展趨勢.細胞培養法生產紫衫醇目前解決紫杉醇資源短缺的途徑主要有化學合成,人工栽培,真菌發酵生產等。由于目前化學合成大多只能從紫杉烷類物質合成,而紫杉烷類物質在紅豆杉中含量同樣很低,成本昂貴。如果人工栽培,至少需要年以上樹齡的的紅豆杉才能提取紫杉醇,周期長,成本也比較高。為此.國內外學者把目標轉移到細胞培養這一領域,并做了大量的研究。細胞培養法生產紫杉醇就是對離體的紅豆杉組織

14、細胞進行培養,從而生產紫杉醇及其衍生物。在理想情況下該方法能夠連續均勻生產,受外界條件影響不大,無污染,而且可以在生物反應器中大規模培養,易于提高產量和進行產物的分離提取純化,是進行工業化生產的首選方法。在細胞培養方面,從年掣獲得紅豆杉細胞培養的第一個專利以來,已經有多種紅豆杉植物建立了細胞懸浮培養系統,培養技術也取得了很大的進展】。、她鼬舢 隨舭舭 觚觚 舢觚 觚犯夠舢 : 七,一,一一 弼 四 歸颶缸一一一觚觚一.美國農業部于年批準了羊等用細胞培養法生產紫杉醇及其類韭塞生匿塹查蘭塑主塹塞生蘭垡堡塞?似物的專利。目前,美國和加拿大處于領先地位,我國也有數家研究所和大學從事該方向的研究。近幾年

15、,這一領域作過許多工作,已研究了 旭胡, , 細,等多個種的植物,用于培養的植物組織有果實、幼嫩莖葉的愈傷組織、胚乳及接合子胚胎等。關于基質添加物也進行了廣泛的研究,并發表了若干專利,結果表明,基質中加入糖或椰汁可提高紫杉醇的產量。中科院昆明植物研究所利用反應器生產紫杉醇,含量達到.%。紫杉細胞培養規模已達,呈現實現工業化生產的可能性。等已目前已通過組織培養的方法成功獲得了紫杉醇、知的紫杉烷類化合物,一些新的紫杉烷類化合物也被發現,其中已獲得專利的新型紫杉烷類成分最有代表性”。,和是中國醫學科學院藥物研究所的研究人員首先從紅豆杉植物愈傷組織培養物中分離得到一類新的紫杉烷類化合物.、。雖然該類化

16、合物尚未發現具有明顯的生理活性,但是由于其具有與紫杉醇類似的基本母核結構,而且含量明顯高于其它的紫杉烷類化合物,所以可望通過結構改造合成紫為底物利用化學杉醇或其它具有藥理活性的紫杉烷類化合物。如等的方法進行合成,得到了中間體,為合成紫杉醇或其類似物提供了個.。很好的前體物【.,?到目前為止,從紅豆杉細胞培養物中至少已鑒定到種以上的化學成分,其中絕大多數與天然紅豆杉的化學成分相同或相似,證明了離體培養的細胞具有合成與天然植物一樣的化合物的“全能性”。有些為新結構的化學成分。進行紅豆杉培養細胞中化學成分的研究,不僅可以從中篩選到一些抗癌活性與紫杉醇相似,但毒副作用更低、來源更豐富的化合物,同時可深

17、入進行對紫杉醇等化合物生物合成途徑的探討,為最終通過基因工程手段來調控化合物的合成打下基礎。.紫杉烷類化合物的生物轉化生物轉化是指利用生物體系以及它們所產生的酶對外源化合進行結構修飾而獲得有價值產物的生理生化物 ,反應,其本質是利用生物體系本身所產生的酶對外源化合物進行酶促催化反應。藥用化學成分的結構往往比較復雜,分子中通常有多個手性中。,采用化學方法對第一章文獻綜述:紫杉醇及其衍生物的研究概況與發展趨勢其進行結構改造有時會遇到各種困難,如選擇性、得率等問題。而生物轉化反應則具有選擇性強、高效率等特點,尤其是易于發生特異性羥基化反應,從而得到具有新穎取代方式的天然衍生物,與有機合成結合,可獲得

18、多種衍生物,為新藥的研究與開發提供先導化合物。.利用植物細胞對紫杉烷類化合物進行生物轉化植物細胞內含有催化酯化、氧化、還原、羧基化、異構化、甲基化、環氧化、糖基化以及去甲基化等反應的酶類,可對天然產物進行轉化。植物細胞的生物轉化可達到三個目的:解決天然藥物的來源問題,把量大的化合物轉化為稀缺的、更有價值的化合物。對化合物進行結構修飾以滿足藥學方面的要求。探索植物次級代謝產物的。生物合成途徑【帕等利用植物銀杏、長春花、桔梗細胞懸浮培養物對/系列化合物進行了生物轉化研究,得到了大量具有立體選擇性的轉化產物,不僅提供了大量可供活性篩選的先導化合物,為紫杉醇的半合成提供前體,同時為最終闡明紫杉醇生物合

19、成路徑提供實驗依據。.紫杉烷類化合物的微生物轉化研究微生物轉化 是利用微生物代謝過程中產生的酶對外源物質進行結構修飾和改造的催化反應。與化學催化劑相比,生物催化劑專一性更強、催化活性更高、條件溫和更易控制,可接受大量的外源復雜分子作為底物,化學選擇性、區域選擇性、立體選擇性或對映選擇性地催化底物生成相應的產物。相對成本低,副產物少,不污染環境,可以進行有機合成所不能或很難形成的化學反應【。生物轉化是一項相對“綠色”的技術。酶促反應能在水相、室溫和中性進行,無需高壓和極端條件,因此節省了過程的能源。用微生物進行生物轉化在某些情況下比利用植物細胞進行生物轉化有優勢。高等植物細胞增殖速度較慢,而微生

20、物繁殖和初級代謝迅速,體內酶體系相對簡單。在極端環境下生存的微生物能提供一些在非常反應條件下發揮作用的酶【”。美國施貴寶公司等利用微生物轉化進行紫杉醇的半合成,他們從白色類、諾卡氏菌 、黃色類諾卡氏菌、莫拉氏菌 .三種微生物的發酵液中分離出一 、. ,分別將紅豆杉中的幾種紫杉烷, 等的、及位進行水解,得,.到較多而單一的.,該產物為紫杉醇合成的前體。再利用化學反應,.。連接上位的側鏈,即可得到紫杉醇“”北京中醫藥大學碩士研究生學位論文,%.%. 利用微生物轉化進行紫杉醇的半合成第一章文獻綜述;紫杉酵及其衍生物的研究概況與發展趨勢紫杉醇的生物合成途徑為了進一步對紫杉醇的生產進行調控,闡明紫杉醇的

21、生物合成路徑是十分必要的。紫杉醇及其位側鏈的生物合成途徑可以分為三個主要的生物合成步驟:.紫杉環系統的生物合成:.側鏈的生物合成;.紫杉環系統和側鏈的酯化反應,形成完整的紫杉烷.。分子。其可能的生物合成途徑見天然紫杉烷類化合物的研究進展獨特而顯著的藥理活性促使人們對紫杉醇進行廣泛研究,然而其發展受到了自身水溶性差./的限制。臨床上應用的紫杉醇是溶于含有 聚乙氧基蓖麻油的乙醇中。這種賦形劑增加紫杉醇溶解性的同時,也引起了一系列的副作用。由此,人們對本屬不同種紅豆杉進行了大量的研究,許多新的紫杉烷類化合物被發現口”。這些研究的目的是希望從中找到新的紫杉醇類似物,了解紫杉醇的生物合成機制,進一步開發

22、紫杉醇的藥源或改善生物活性。等從中國紅豆杉.和云南紅豆杉的地上部分分離得到十二個紫杉烷類化合物,并且對它們進行了細胞毒性評價。結果表明,它們對多藥耐藥腫瘤細胞,.及肺腫瘤細胞都有不同程度的細胞毒性【。等從臺灣特有的紅豆杉的枝葉中先后分離得到了十個新的紫杉烷類衍生物。其中一個化合物的結構是罕見的一,雙重排紫杉烷類化合物,被認為是該種植物的特征成分【。展望綜上所述,相信隨著對紫杉類化合物研究的不斷深入和經驗的積累以及新的生物技術的應用,對紫杉類化合物在生物體內的生物合成會有更多得了解,將有更多高效低毒的新型紫杉烷類物上市并進入臨床應用造福人類。北京中醫藥大學碩士研究生學位論文 .第二章實驗部分:紅

23、豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離第二章實驗部分.紅豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離.前言不少來源于植物的藥物,雖然可以實現化學全合成,但有些化合物由于其合成路線非常繁瑣,成本過高或收率太低而無法實現工業化生產;有些化合物則由于其結構非常復雜而無法實現用化學方法合成。所以,這些藥物仍需要依賴生物來源,由此引發的資源爭奪而造成生態破壞,影響深遠。由于紫杉醇的稀缺,紅豆杉的野生資源慘遭破壞,因此,紅豆杉的資源保護和可持續發展已成為首要考慮的問題,在各種解決方案中,生物技術方法,特別是細胞培養方法具有獨特的優勢,其研究也已經達到了一定的深度和廣度,表現出極大的潛力。該方法能夠連續均勻生產,受外

24、界條件影響不大,無污染,而且可以在生物反應器中大規模培養,易于提高產量和進行產物的分離提取純化,是進行工業化生產的首選方法。從年等.獲得紅豆杉細胞培養的第一個專利以來,已經有多種紅豆杉植物建立了細胞懸浮培養系統,培養技術也取得了很大的進展【】。從紅豆杉細胞培養物中分離得到的化學成分,絕大多數與天然紅豆杉的化學成分相同或相似,證明了離體培養的細胞具有合成與天然植物一樣的化合物的“全能性”。進行紅豆杉培養細胞中化學成分的研究,不僅可以從中篩選到一些抗癌活性與紫杉醇相似,但毒副作用更低、來源更豐富的化合物,同時可深入進行對紫杉醇等化合物生物合成途徑的探討,為最終通過基因工程手段來調控化合物的合成打下

25、基礎。,是首先從紅豆杉植物愈傷組織培養物中分離得到一類新的紫杉烷類化合物,其結構新穎,雖然該類化合物尚未發現具有明顯的生理活性,但是由于其具有與紫杉醇類似的基本母核結構,而且含量明顯高于其它的紫杉烷類化合物,具有改造成為新抗癌藥物的可能性。目前由紅豆杉細胞懸浮培養生產紫杉醇還存在兩個重要問題尚需解決:一是獲得高紫杉醇含量的紅豆杉細胞系;二是能夠得到在大規模生物反應器中具有良好的耐受性和高生長速度的紅豆杉細胞系。目前解決這兩方面的問題主要寄希望于通過對紫杉醇生物合成過程的充分了解和利用現代基因工程方法來對紅豆杉從基因水平上進行改造,并且發展更好的細胞大規模培養方法”。本論文所研究的紅豆杉愈傷組織

26、培養物為.號細胞系。以前的提取方法是用乙,醚進行索氏提取,得到的成分主要是,和煳,用作有機合成前體或生物轉化的底物。但我們通過等手段在實驗過程中發現,乙醚提取過的殘渣再用乙醇%提取,提取液中尚存在其它少量的紫杉烷類化合物,限于培養的規模不大,不能鑒定出這些化合物的結構。本實驗的目的是提取并分離得到北京中醫藥大學碩士研究生學位論文擴大規模培養的紅豆杉愈傷組織中的微量成分。結果共得到十個單體化合物,除上述,和之外,還得到其它六個化合物,其中四個為新化合物。.實驗材料.儀器與材料紅豆杉組織培養物為中國醫學科學院藥物研究所生物合成室培養的.號細胞系:一型高效液相色譜儀,.型檢測器,色譜柱為.,.;美國

27、公司核磁共振譜儀:.內標:美國尼高力公司傅立葉變換紅外光譜儀:壓片;旋光儀:質譜儀美國公司;?上海愛朗儀器有限公司 .型旋轉蒸發儀。.藥品與試劑核磁試劑:氘代氯仿北京化工廠;高效液相試劑正相:正己烷、乙酸乙酯、丙酮分析純,北京化工廠:其他:石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氯仿、正丁醇分析純,北京化工廠柱層析和薄層硅膠等均系青島海洋化工廠生產;薄層色譜硅膠預制板為煙臺市化學工業研究所生產;薄層層析檢測用%/溶液顯色或紫外顯色。.提取與分離本實驗對紅豆杉愈傷組織進行提取與分離,利用硅膠柱層析和高效液相色譜法進行化合物的分離,純化,共得到個單體化合物。取.號紅豆杉細胞系培養物,在下烘干,粉碎后,采用乙

28、醚進行索氏提取,小時,至提取液基本無色,得到乙醚部分浸膏左右,其主要成分為, ,和,用作有機合成前體或生物轉化的底物備用。再將乙醚提取后的殘渣用%乙醇冷浸提取一個月,將提取液減壓濃縮,得到總的浸膏量為左右。加水懸浮后,以乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯部分浸膏。如圖.上述乙酸乙酯部分以丙酮溶解,用兩倍量.目硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的柱層析硅膠.目進行柱層析分離,以石油醚一丙酮系統梯度洗脫,共得到四部分:?:.; :.; ?:.;一:.如圖第二章實驗部分:紅豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離.。號紅豆杉細胞系培養物上,烘干干燥培養物上乙醚,索氏提取,小時殘渣乙醚部分浸膏山%乙醇冷浸一個月山柱層析、

29、 提取液山減壓濃縮山浸膏收率%上加水懸浮有機合成或生物轉化備用水懸浮液山乙酸乙酯萃取乙酸乙酯部分浸膏收率.%圖.紅豆杉愈傷組織提取物的分離流程圖圖. 紅豆杉培養物乙酸乙酷部分提取物的分離流程圖北京中醫藥大學碩士研究生學位論文將以丙酮溶解,兩倍量硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠.目進行柱層析分離,流動相為石油醚一丙酮系統梯度洗脫:一純丙酮,共得到三個化合物:,和如圖這三個化合物均為無色棱晶,易溶于丙酮,%溶液犀棕褐色斑點。圖. 紅豆杉愈傷組織提取物部分的分離流程圖將以丙酮溶解,兩倍量硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠.目進行柱層析分離,石油醚一丙酮系統梯度洗脫:一純丙酮,共得到五部分. 。再分別將

30、.以丙酮溶解,兩倍量硅膠拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠目進行柱層析分離,石油醚一丙酮系統梯度洗脫,利用高效液相色譜進行反復分離附圖.。共得到七個化合物,其中三個為已知化合物,即. ,;另外四個為新化合物,為 、,.、腳和 圖.。這四個新化合物均易溶于丙酮,以下是它們的質譜和紅外光譜的數據。化合物和的在/:處給出準分予離子峰【】,并給出碎片離子峰在/:、;紅外光譜數據為:.、 、。化合物的在:處給出準分子離子峰【】,并給出碎片離子峰在/:、;紅外、 、 、 、光譜數據為: 。化合物的.在/:處給出準分子離子峰口】,并給出碎片離子峰在/:、第二章實驗部分:紅豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離、;紅

31、外光譜數據為: 、 、 、 。圖.紅豆杉愈傷組織提取物部分的分離流程圖.結構鑒定化合物,無色菱形結晶,展開后,以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點。.譜附圖 .中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.,.和.的三個單峰為個乙酰氧基質子的信號:.和.處的兩個寬單峰是環外雙鍵的末端烯氫,這是一雙鍵型紫杉北京中醫藥大學碩士研究生學位論文圈.類化舍韻的結構式“化合物和第二章實驗部分:紅豆杉組織培葬物中化學成分的提取與分離烷類成分的特征信號;.和.分別是側鏈上位和位甲基信號,其信號數據均與文獻報道,一一.,.的數據一致【。經檢驗,其斑點與 標準品位置相同顏色一致。由此推定化合物為 結構

32、式見圖.。.,;.,. .,. .,.,.,.,.,. .,.,.,. .,.,.,.,. .,. .,. .,. .,.,.,.,. . .,.,. .,.,. .,.,. .,.,. .,.,. .,.,.,.,. .,. .,.,. .曲. . . . . .,.,. .化.,. .。.,. .,.,. . . . .化合物,無色菱形結晶,展開后,以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點。譜附圖.中,.,.,.,.:為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.,.和.的蘭個單峰為個乙酰氧基質子的信號;.采.處的兩個寬單峰是環外雙鍵的末端烯氫,是.雙鍵型紫杉烷類成分的特征信號;.處的三重峰是側鏈上

33、位的甲基信號,.處的四重峰是側鏈上位上的亞甲基信號。信號數據均與文獻報道剛的北京中醫藥大學碩士研究生學位論文,一一,的數據一致。圣檢驗,斑點與標準品位置相同顏色一致。由此推定化合物為 結構式見圖.。化合物,無色菱形結晶,展開后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點。?譜附圖.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.,.和.的三個單峰為個乙酰氧基質子的信號;.和.處的兩個寬單峰是環外雙鍵的末端烯氫,這是.雙鍵型紫杉烷類成分的特征信號:.處的單峰是側鏈上位上的甲基信號。其信號數據均與文獻報道【】的,.,的數據一致。經檢驗,斑點與標準品位置相同顏色一致。由此推定化合物為結構式見圖.。化合物

34、為無色粉末。經展開后,以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點。譜附圖 .中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.的單峰為側鏈位上甲基;.和.的兩個單峰為個乙酰氧基質子的信號,比少了一個乙酰氧基質子信號;.的質子信號從的.向高場移動至.,鄰位氫.從的.向高場移動至.,間位氫.,.質子信號均向低場移動;其信號數據均與文獻報道【的,?結構式見.,的數據一致。由此推定化合物為圖.。化合物,無色菱形結晶,展開后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點。譜附圖 .中,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.,.和.的三個單峰為個乙酰氧基質子的信號:.和.處的兩個寬單峰是環外雙鍵的末端

35、烯氫,這是雙鍵型紫杉烷類成分的特征信號;.和.分別是側鏈上位和位甲基信號,其.信號數據均與文獻報道】的,?一一?.,.的數據一致又稱云南紅豆杉甲素。經檢驗,斑點與/標準品位置相同顏色一致。由此推定化合物為結構式見圖.。化合物為無色粉末。經展開后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點。譜附圖.中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基比較,側鏈上甲基質子信號消失:信號,分別為,和甲基;與.和.的三個單峰為個乙酰氧基質子的信號皿一的質子信號從的.向高場移動至.,鄰位氫從的.向高場移動至.,其余的信號數據均與文獻報道四的.,.,.的數據一致。由此推定化合第二章實驗部分:紅豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離物

36、為 結構式見圖.。.,化臺物為無色粉末。經展開后,以%溶液顯色,呈棕褐色斑點。其在/處顯示準分子離子峰【】十,提示分子量為,比的分子量小,與分予式一致,同時給出/:,等碎片離子峰附圖;其和”譜與相似;“譜附圖,中只有三個乙酰氧基的羰基信號,推測化合物是少了一個乙酰氧基;譜附圖.中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;和.的兩個單峰為個乙酰氧基質子的信號;與比較,少了一個乙酰氧基質子信號;.是.的質子信號,與的.相比,位于相對高場;鄰位氫一北京中醫藥大學碩士研究生學位論文.與的。相比也處于相對高場間位氫.,.質子化學位移均處于相對低場,表明可能是.位為羥基取代;而譜中一位

37、的碳信號與相比向高場移動了.,進一步表明.位為羥基取代;因此推定其結構為?,?一?一。由此推定化合物為 ,為一新化合物結構式見圖.。. . .化合物為無色針狀結晶。展開后,以%.溶液顯色,呈棕褐色斑點。其在/處顯示準分子離子峰【,提示分子量為,比 的分子量大,與分子式一致,同時給出:第二章實驗部分:紅豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離,等碎片離子峰附圖。光譜可見明顯的羥基峰和雙鍵 。其 .譜與,酯羰基相似;譜附圖.中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.,.和.的三個單峰為個乙酰. . ¨. . . ,.,.,., .,.,. ,.,. .,.。,.,.

38、.,.,.,.,.,.,. .,. .,.,.氧基質子的信號;.和.處的兩個寬單峰是環外雙鍵的末端烯氫,是一雙相比,鍵型紫杉烷類成分的特征信號;.是側鏈上位的甲基信號,與位的甲基信號,與化學位移值低了,而且氫的數目少了一個;.是相比,也處于相對低場,且為二重峰;其余的信號數據與 基本一致,這說明位的一個氫可能被羥基取代;譜附圖, .的.位的碳信號北京中醫藥大學碩士研究生學位論文.的.相比處于相對低場,位的碳信號.,與 與的.相比處于相對低場,進一步說明位的一個氫被羥基取代;因此推定其結構為伍,一.一,。由此推定化合物為 ,是一個新化合物結構式見圖.。.; 化合物和為無色粉末。展開后,以%/溶液

39、顯色,為兩個值不同的棕褐色斑點。二化合物的.在/處顯示準分子離予峰第二章實驗部分:紅豆杉組織培養物中化學成分的提取與分離,提示分子量為,與的分子量相同,與分子式一致,并給出/:,等碎片離子峰【附圖;附圖】。二者的.和”?譜幾乎完全一致,并與相似。譜附圖;附圖 .】,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號;.,.和.的三個單峰為個乙酰氧基質子的信號;.和.處的兩個寬單峰是環外雙鍵的末端烯氫;側鏈一,.的質子信號分別為.,.;側鏈一質子信號. 與的.相比處于相對低場,.的質子信號.與的.相比處于相對高場:說明 位氫很可能被羥基取代,而位沒有羥基取代;而”.譜附圖.沖.位的碳信號.與的.相比處于

40、相對低場,.位的碳信號.與的.相比處于相對高場,進一步說明位的一個氫被羥基取代,而位沒有羥基取代了;化合物和是一對異構體,位上羥基的絕對構型尚需其它分析方法進行確認。二者都是新化合物,結構為旺,?,。結構式。見圖.。命名為 和北京中醫藥大學碩士研究生學位論文云南紅豆杉甲素的微生物轉化.前言微生物轉化 是利用微生物代謝過程中產生的酶對外源物質進行結構修飾和改造的催化反應。微生物轉化的研究內容包括轉化反應的篩選,擴大培養,轉化產物的提取分離,結構鑒定及活性篩選。藥用化學成分的結構往往比較復雜,分子中通常有多個手性中心,采用化學方法對其進行結構改造有時會遇到各種困難,如選擇性、得率等問題。與化學催化

41、劑相比,生物催化劑專一性更強、活性高、條件溫和,化學選擇性、區域選擇性、立體選擇性或對映選擇性地催化底物生成相應的產物,可以進行有機合成所不能或很難形成的化學反應。該法相對成本低,副產物少,不污染環境,是一項相對“綠色”的技術。由于微生物的多樣性和微生物體內酶的多樣性,微生物可以對各種化學物質進行不同形式的結構修飾,因此微生物轉化具有生產一些有用的已知或未知產物的巨大潛力。再通過活性篩選,可以找到新的高效低毒的天然活性先導化合物,或通過對活性組分中不同成分結構變化或活性強度消長關系的分析發現關鍵活性成分。或與有機合成結合,可獲得多種衍生物,為新藥的研究與開發提供先導化合物。微生物的倍增時間短,

42、生物量積累快,從而產生的酶量相應增多,轉化時間短,這些特點,便于微生物轉化的規模化應用。同時微生物的基因工程研究工作成熟,使轉化酶的高表達成為可能,且微生物的發酵工藝成熟,便于擴大。.實驗材料.儀器與材料.型高效液相色譜儀,.型檢測器,色譜柱:×.,;美國公司核磁共振譜儀:.內標;美國尼高力公司傅立葉變換紅外光譜儀:壓片;旋光儀:質譜儀美國公司;型旋轉蒸發儀.上海愛朗儀器有限公司.藥品與試劑云南紅豆杉甲素,由.號紅豆杉細胞系培養物中分離得到。核磁試劑:氘代氯仿北京化工廠:流動相:正己烷、乙酸乙酯、丙酮分析純,北京化工廠;其他:石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、氯仿、正丁醇分析純,北京化工

43、廠。柱層析和薄層硅膠等均系青島海洋化工廠生產;北京中醫藥大學碩士研究生學位論文養天后停止培養,分別將培養液用布氏漏斗抽濾,過濾得到的菌液則用等體積乙酸乙酯分別萃取次。合并萃取液,蒸千;過濾得到的菌絲體,分別用乙酸乙酯超聲提取,蒸干。將菌液與菌絲部分分別以少量丙酮溶解,以薄層層析對轉化產物進行檢測,與底物對照點樣。薄層層析展開荊為石油醚:丙酮:。實驗流程如圖.。利用二十八種菌株對/.進行生物轉化的預試驗,比較各菌株的轉化結果后,選擇“方”號菌對】進行放大微生物轉化,并得到一個主要轉化產物:化含物見表.。.擴大培養將檢測有轉化跡象的方號菌株進行擴大培養。從試管斜面將微生物接入兩個三角瓶內裝液,懸浮

44、培養小時,溫度恒定,轉速恒定/,再以瓶的接種量轉入三角瓶內裝液,懸浮培養小時,溫度恒定室溫,轉速恒定/,長勢旺盛,加入底物.。底物以丙酮溶解,配制濃度為/,每瓶投放底物的量為即。相同條件下繼續培養天后停止,將培養液合并,用布氏漏斗抽濾,過濾得到的菌液用等體積乙酸乙酯萃取次,合并萃取液,減壓蒸干;菌絲體用乙酸乙酯超聲提取三次,每次更換新溶劑,每次,合并蒸干。.提取與分離將菌液與菌絲部分各自以少量丙酮溶解,用兩倍量的柱層析硅膠.目拌樣,以三十倍于樣品量的硅膠目進行柱層析分離,流動相為石油醚.丙酮系統:%酮梯度洗脫,收集流份。得到轉化產物,經光譜技術鑒定為去乙酰云南紅豆杉甲素 ,共結構式見圖.。圖.

45、 .去乙酰云南紅豆杉甲素的結構式第二章實驗部分:云南紅豆杉甲素的微生物轉化表.三十五種菌株對進行微生物轉化的初篩結果篩選結果菌種名及代號.小刺青霉如.蘋果木層孔菌. .尖孢鐮孢 .刺孢小克銀漢霉. .木賊鐮孢 如.亞麻刺盤孢 .鏈格孢 .釀酒酵母.梨葉點霉一.立枯絲核菌。.雅致小克銀漢霉 .灰葡萄孢.&珊瑚諾卡氏菌 口. .絳紅諾卡氏菌.北京棒桿菌.食油假單胞菌.鈍齒棒桿菌 .谷氨酸棒桿菌 .恥垢分枝桿菌 灰綠犁頭霉.藍色犁頭霉方十方方”方方。方十方方方菌菌菌菌.表示無轉化跡象表示有轉化跡象表示轉化跡象明顯北京中醫藥丈學碩士研究生學位論文.轉化產物的結構鑒定化合物,無色粉末狀。展開后,

46、以%/溶液顯色,呈棕褐色斑點。.譜附圖 .中,.,.,.,.為紫杉烷骨架上的四個甲基信號,分別為,和甲基;.和.的兩個單峰為個乙酰氧基質子的信. .”.?的質子信號從號,比肌少了一個;說明少了一個乙酰氧基的取代;的.向高場移動到.:說明位的乙酰氧基被羥基代替了。其余的信號數據均與文獻報道【】的.,的數據一致。由此推.一,第二章實驗部分:云南紅豆杉甲素的微生物轉化定化合物為? 結構式見圖.。其生物轉化反應過程如圖.。?翌:蘭竺竺苧蘭蘭蘭蘭蘭蘭轉化率%圖.利用“方”號菌對進行微生物轉化的反應過程從底物和上述產物結構來看,該菌能特異性的水解.上的乙酰氧基,而且轉化產率在%以上,該反應具有高度的位置選擇性,這是化學合成不容易做到的,為進一步將衍生化成其他活性化合物奠定基礎。北京中醫藥大學碩士研究生學位論文第三章 論文總結與創新點.全文總結