1、實(shí)驗(yàn)一農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備目的及要求了解和掌握農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備的原理和方法。實(shí)驗(yàn)原理在利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化中，首先要獲得含有目的基因的農(nóng)桿菌工程菌株。在基因工程操作中，感受態(tài)細(xì)胞的制備和質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是一項(xiàng)基本技術(shù)。感受態(tài)是細(xì)菌細(xì)胞具有的能夠接受外源DNA勺一種特殊生理狀態(tài)。農(nóng)桿菌的感受態(tài)可用CaCl2處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生。將正在生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0c下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于-70C可保存相當(dāng)一段時(shí)間而不會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化效率有太大的影響。實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑一、儀器：超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，冷凍高速

2、離心機(jī)，高壓滅菌鍋，冰箱，-70C超低溫冰柜，分光光度計(jì)，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進(jìn)樣器及吸頭。以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120c,15分鐘。二、材料：土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株三、試劑：YEB夜體培養(yǎng)基（1L）:酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白陳5g,蔗糖5g,MgSO-7H2O0.5g,pH7.0,高壓滅菌。利福平（Rif）儲(chǔ)液：50mg/ml20mMCaGl,高壓滅菌。實(shí)驗(yàn)步驟1、挑取根癌農(nóng)桿菌LBA440必菌落于3ml的YEB1體培養(yǎng)基（含Rif50mg/l）中，28c振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2、取過(guò)夜培養(yǎng)菌液1ml接

3、種于50mlYEB（Rif50mg/l）液體培養(yǎng)基中，28c振蕩培養(yǎng)至OD00為0.5;3、取2ml菌液，13000rpm,離心30sec,棄上清；4、加入1000d20mMCaClz,使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30min；5、13000rpm,離心30sec,棄上清，置于冰上，加入500M預(yù)冷的20mMCaCb,充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24hr內(nèi)使用，或液氮中速凍1min,置-70C保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA1接導(dǎo)入農(nóng)桿菌目的及要求了解和掌握質(zhì)粒DNA專化農(nóng)桿菌細(xì)胞的原理和方法，獲得能用于植物轉(zhuǎn)化的工程菌。實(shí)驗(yàn)原理在低溫下，外源DNA（質(zhì)粒）可吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面，誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA（加入

4、熱激原理）轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA勺農(nóng)桿菌隨后28c恢復(fù)培養(yǎng)，可使質(zhì)粒上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表達(dá)，因此，轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞可在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而沒(méi)有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞則無(wú)法生長(zhǎng)。植物真核表達(dá)載體pCAMBIA1300fl譜實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑一、儀器：超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)箱，臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋，高壓滅菌鍋，-70C超低溫冰箱，培養(yǎng)皿，微量進(jìn)樣器及吸頭。材料：根癌農(nóng)桿菌LBA4404（或EHA105感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒pCAMBAI1300+SPR植物表達(dá)載體二、試劑：液氮YEB夜體培養(yǎng)基（1L）:酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白陳5g,蔗糖5g,MgSO7Ho0.5g,pH7.0

5、,高壓滅菌。YEB固體培養(yǎng)基：每升YEB液體培養(yǎng)基加15g瓊脂粉，高壓滅菌。卡那霉素（Kan）儲(chǔ)液：50mg/ml利福平（Rif）儲(chǔ)液：50mg/mlYEB固體培養(yǎng)基平板（Kan抗性）：滅菌后的YEB固體培養(yǎng)基待其溫度降至50c時(shí)加入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）,至終濃度分別為100聞/ml和50皿ml,混勻后立即倒入培養(yǎng)皿，凝固后4c倒置保存。實(shí)驗(yàn)步驟1、在200M感受態(tài)細(xì)胞中加入26d質(zhì)粒（pBI121）DNA冰浴5min,液氮中速凍5min；2、迅速轉(zhuǎn)入37c水浴中，熱激5min；3、加入1mlYEB液體培養(yǎng)基，28c慢速振蕩培養(yǎng)24小時(shí)；4、3000rpm離心4min,去一部分

6、上清，留取200M菌液涂布于含有50國(guó)/mlKan和50©mlRif的YEB平板；5、放置約0.5h,待水份干后，28c培養(yǎng)約24小時(shí)至長(zhǎng)出菌落。實(shí)驗(yàn)三農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定目的及要求掌握農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA勺提取方法。將從農(nóng)桿菌提取的質(zhì)粒與對(duì)照質(zhì)粒同時(shí)電泳，通過(guò)比較確定獲得了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)改造的Ti質(zhì)粒(只含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir區(qū))存在于農(nóng)桿菌工程菌株中，含有T-DNA的雙元載體(BinoryVectors)完成重組后可以在大腸桿菌中擴(kuò)增，再轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。從抗性培養(yǎng)基上篩選得到的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子中應(yīng)攜帶轉(zhuǎn)入的重組質(zhì)粒，而對(duì)照菌株則沒(méi)有。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的

7、質(zhì)粒DNAI®取方法，該法用于從小量培養(yǎng)物中抽提質(zhì)粒DNA比較方便、省時(shí)，提取的DN頌量較高，可用于DNA勺酶切、PCF©至測(cè)序。提取質(zhì)粒DNA1基于染色體DNAW質(zhì)粒DNA勺變性與復(fù)性的差異而使其分離。當(dāng)細(xì)胞在NaOH和SDS容液中裂解時(shí)，在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，蛋白質(zhì)和染色體DN儂生變性，染色體DNA勺氫鍵斷裂、雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，而質(zhì)粒DNAS大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)加入中和液醋酸鉀或醋酸鈉高鹽緩沖液時(shí)，質(zhì)粒DNAR復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，而染色體DNA能復(fù)性，形成纏繞的網(wǎng)狀2構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物隨細(xì)胞

8、碎片等沉淀下來(lái)，質(zhì)粒DNAU留在上清中。實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑一、儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，恒溫?fù)u床，恒溫水浴，電泳儀及電泳槽，紫外燈，加樣器(pipettor)，小離心管(eppendorftube),吸頭(tip),三角瓶，牙簽。二、材料：含質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404或EHA105，農(nóng)桿菌LBA4404或EHA105三、試劑：YEB夜體培養(yǎng)基(1L):酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白陳5g,蔗糖5g,MgSO-7H2O0.5g,pH7.0,高壓滅菌。溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0),高壓滅菌(6.895

9、X104Pa),4c保存溶液H:0.2mol/LNaOH,1%SDS先分別配成濃度0.4MNaOH(滅菌)及2%SDS,用前等體積混合。溶液出：3mol/LNaAc/KAc(pH4.8)105mol/LNaAc/KAc60ml(滅菌)HAc11.5mlHO28.5ml(滅菌)，三者混合EB:貯液濃度為10mg/mL工作濃度為0.5聞/mlTAE40mmol/LTris-HAc,2mmol/LEDTApH8.0,Tris飽和酚、氯仿、無(wú)水乙醇、RNaseA實(shí)驗(yàn)步驟1、質(zhì)粒DNA勺提取(1)挑取一個(gè)單菌落接種于3ml含相應(yīng)抗生素的YEB(50mg/LKnj)液體培養(yǎng)基中，28c劇烈振蕩過(guò)夜；(2)

10、收集1.5ml過(guò)夜培養(yǎng)物于1.5ml離心管中，10000rpm離心30sec收集菌體，盡可能除盡培養(yǎng)基；(3)向細(xì)胞沉淀中加入100d預(yù)冷的溶液I,劇烈振蕩，使菌體充分懸浮；(4)加入200膜溶液H,立即溫和顛倒離心管4-10次，避免劇烈振蕩；(5)加入150屋溶液田，溫和顛倒離心管4-10次，將離心管置冰浴5min；(6)于室溫12000g離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(盡量避免吸取沉淀)；(7)加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻；(8)12000g離心10min,棄上清液，加入400仙l70%J享,12000g離心8min,棄上清，在真空抽干或在超凈工作臺(tái)中吹干；(9)加入10M

11、含20閨/mlRNaseA的TE或重蒸水溶解DNA37°C溫育30min；(10)-20C保存。2、用瓊脂糖電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA(或用PCRa行檢測(cè))用1XTAE配制0.8%的瓊脂糖凝膠，取所提取的質(zhì)粒DNA容7取2-5pl進(jìn)行電泳，50-100V約0.5-1hr,紫外燈下觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四煙草遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義煙草是遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物，已經(jīng)建立了一套完善的轉(zhuǎn)化再生體系。本實(shí)驗(yàn)以煙草為實(shí)驗(yàn)材料，使同學(xué)們了解根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的基本原理和一般步驟，掌握遺傳轉(zhuǎn)化的基本操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)器材搖床、超凈工作臺(tái)、冰箱、移液搶、銀子、手術(shù)刀、打孔器、酒精燈、棉球、培養(yǎng)皿、三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙簽

12、。實(shí)驗(yàn)藥品MSW養(yǎng)基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、瓊脂、蔗糖、卡那霉素、竣卞青霉素、無(wú)菌水、6-BA、NAA0.1%升汞、70%.醇。煙草愈傷誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基：MSP6-BA(1.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)煙草生根培養(yǎng)基：MS+NAA(0.1mg/L)煙草選擇培養(yǎng)基：M濟(jì)6-BA(1.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)+75mg/LKm+500mg/L竣卞青霉素(Cb)實(shí)驗(yàn)步驟1 .受體材料的準(zhǔn)備與預(yù)培養(yǎng)(1)取自田間栽培煙草植株，用蒸儲(chǔ)水沖洗1遍后，以70%L醇清洗45s,再以0.1%的升汞消毒6-8min,無(wú)菌水沖洗5遍，無(wú)菌濾紙吸干水分。(2)用滅過(guò)菌的打孔器將無(wú)菌煙

13、草葉片鑿成6mmi勺葉盤(或用手術(shù)刀切成510mnj!r形葉片。(3)將葉盤或葉片接種在煙草愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)23天，材料切口處剛剛開始彭大時(shí)備用。2 .根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)從平板上挑取單菌落，接種到20mLW加相應(yīng)抗生素(卡那霉素)的YEB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上，于28c下以180r/min培養(yǎng)至。詼為0.60.8(約需17h)。(2)。聯(lián)0為0.60.8的菌液，按1%2%j比例，轉(zhuǎn)入新配制的無(wú)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，可同時(shí)加入100500叩ol/L的乙酰丁香酮。在上述相同的條件下再培養(yǎng)6h左右，待。瓦為0.20.5時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化。3 .浸染在超凈工作臺(tái)上，將菌液倒入無(wú)菌三角瓶中，從培養(yǎng)瓶中取出預(yù)培養(yǎng)過(guò)的外植體，放入菌液中，浸泡適當(dāng)時(shí)間(530min)。取出外植體置于無(wú)菌濾紙上吸去附著的菌液。4 .共培養(yǎng)將浸染過(guò)的外植體接種在煙草愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基上，在28C暗培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)24天。5 .選擇培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的外植體移到加有選擇壓的煙草愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基(附加500mg/L的竣葦青霉素，抑制根癌農(nóng)標(biāo)菌生長(zhǎng))上，在光照為2000100001X、25c條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。6 .繼代選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)2-3周后，外植體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將分化出抗性不定芽或產(chǎn)生抗性愈傷組織，將這些抗性材料轉(zhuǎn)入相相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行繼