1、藤黃菌素體外對重組人卵白激酶CK2全酶的按捺作用林小聰，劉新光，陳小文，陳偉珠，梁念慈【關鍵詞】酶動力學InhibitryeffetflutelinnrebinanthuanprtEinkinaseK2hlenzyeinvitr【Keyrds】prteinkinaseK2;rebinantprteins;hlenzye;lutelin;enzyekinetis【摘要】目的：不雅察體外藤黃菌素對重組人卵白激酶K2的按捺結果及舉行酶動力學闡發以確定其按捺作用范例.要領：使用基因工程技能舉行克壟表達和純化，得到重組人K2的及亞基,并在體外等摩爾混淆構成K2全酶.通過測定藥物作用后轉移到K2底物上的3

2、2PATP的32P的放射性活度來檢測藤黃菌素對酶的按捺作用及接納LineeaverBurk作圖法闡發其動力學.結果：藤黃菌素能明顯按捺重組人卵白激酶K2的活性I50=0.86l/L.酶動力學闡發表白，藤黃菌素與ATP呈競爭性按捺K2的活性Ki=0.19l/L,與酪卵白那么呈混淆性按捺K2的活性Ki=0.11l/L.結論：藤黃菌素是一種較強的體外卵白激酶K2的按捺劑.【關鍵詞】卵白激酶K2；重組卵白；全酶；藤黃菌素；酶動力學0弁言卵白激酶K2全酶是由2個催化亞基(和/或)及2個調治亞基()所構成的異源四聚體，重要有22,22或23種情勢1-2，具有埋伏的致瘤活性并與腫瘤的產生有著嚴密的接洽3.藤

3、黃菌素(lutelin)大概會影響K2的活性，因此我們選擇藤黃菌素作為研究工具，在已克壟表達和純化人K2及亞基的底子上4-5，探究其對重組人卵白激酶K2全酶的按捺作用及其動力學，為進一步探求新型的抗腫瘤和抗病毒藥物奠基精良的底子.1質料和要領11質料藤黃菌素為Aldrih公司產物.組卵白S，多聚谷氨酸和酪氨酸復合物Ply(GluTyr)41，肝素，精胺和ATP購自Siga公司.5，6二氯1呋喃糖苯并咪唑(DRB)為albihe公司產物.P81磷酸纖維素濾紙購自hatan公司.32PATP為北京福瑞生物醫學工程公司消費.12要領人K2和亞基DNA重組質粒pTKA和pTKB的克隆與測序見文獻4.重

4、組人K2和亞基的原核表達、純化與斷定見文獻4-5.卵白定量：按通例的考馬斯亮藍G250染色法，以牛血明凈卵白作為尺度.卵白激酶K2的活性測定要領見文獻6.將純化的重組人K2與亞基按等摩爾(14pl)混淆構成重組人K2全酶.在每個反響管中別離參加差異濃度的藤黃菌素10L，參加反響混淆液15L，以全酶10L啟動反響不雅察藤黃菌素對K2全酶活性的影響.按照半數效量概率單元法11盤算I50.以濃度的對數為橫坐標，相應濃度按捺率的概率單元(prbit)為縱坐標，求出直線回歸方程，并按照方程盤算I50值(50%按捺時的概率單元為5).按照I50結果，選擇3種濃度的藤黃菌素(0，1，2l/L)舉行分組.在酪

5、卵白濃度為2g/L，ATP濃度為10，20，40，80l/L環境下測定K2的活性；或在結實ATP的濃度為10l/L，改變酪卵白濃度(1，2，4，8g/L)條件下測定K2活性，每個樣品同時做3個平行管,接納LineeaverBurk作圖法求出酶動力學參數表不雅K和表不雅Vax,以此斷定藤黃菌素對K2按捺作用范例.2結果21重組人K2全酶的性子將重組人K2與亞基等摩爾混淆后構成的重組全酶，具有與自然K2同等的性子，可用酪卵白作底物；而用組卵白S和TPK的底物Ply(GluTyr)41作底物時，K2的活性那么很低表1.別的，重組人K2全酶的活性受到肝素和K2特異性按捺劑DRB的按捺，精胺那么有激活作

6、用.而一些第二信使分子，如AP，GP和a2+那么對K2的活性根本沒有影響表2.表1差異底物存鄙人測定的重組人卵白激酶K2全酶活性(略)22藤黃菌素對重組人K2全酶的直接作用向反響體系中參加0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，2.00l/L藤黃菌素，其K2活性占比較組K2活性的百分數別離為(61.51.6)%，(54.10.6)%，(50.77.2)%，(46.45.6)%，(33.53.9)%，(15.94.3)%；提示藤黃菌素對重組人K2全酶有較強的按捺作用，且隨著藤黃菌素濃度的不竭增長，K2全酶活性漸漸低落，出現濃度依靠性干系；直線回歸方程為：Y=1.9987X-0.8502

7、，r2=0.8203(P0.05)；按照方程盤算的I50值為0.86l/L.表26種化合物對重組人卵白激酶K2全酶活性的影響(略)圖1差異ATP濃度環境下LineeaverBurk作圖法得出藤黃菌素對重組人K2全酶按捺作用的動力學(略)圖2差異酪卵白濃度環境下LineeaverBurk作圖法得出藤黃菌素對重組人K2全酶按捺作用的動力學(略)3討論【參考文獻】1LithfieldD.PrtEinkinaseK2:Struture,regulatinandrleinellulardeisinsflifeanddeathJ.BiheJ,2022,369(Pt1):1-15.2黃功華,劉新光,梁念慈.

8、卵白激酶K2的研究希望J.生命的化學,2022,23(3):169-171.3HessenauerA,ntenarh,Gtz.InhibitinfK2ativityprvkesdifferentrespnsesinhrnesensitiveandhrnerefratryprstateanerellsJ.IntJnl,2022,22(6):1263-1270.4陳小文,劉新光,梁念慈.人卵白激酶K2亞基在大腸桿菌中的克壟表達及其重組卵白的純化及性子斷定J.中國生物化學與分子生物學報,2022,20(2):176-182.5劉新光,梁念慈,馬澗泉.重組人K2亞基的原核表達、純化與斷定J.生物化學與生物物理希望,2000,27(2):201-205.6劉新光,梁念慈.AG1109對重組人卵白激酶K2全酶的按捺作用J.癌癥,2002,21(2):153-157.7BlanquetPR.aseinkinase2asaptentiallyiprtantenzyei