1、實驗實驗6 6 -淀粉酶的固定化及淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測淀粉水解作用的檢測 酶作為生物催化劑酶作為生物催化劑, ,具有專一性和高效性具有專一性和高效性. .現(xiàn)在被大量使用在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。現(xiàn)在被大量使用在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而，在應(yīng)用酶的過程中，人們也發(fā)現(xiàn)了一些然而，在應(yīng)用酶的過程中，人們也發(fā)現(xiàn)了一些實際問題：實際問題： （1 1）不穩(wěn)定不穩(wěn)定：酶通常對強酸、強堿、高溫和：酶通常對強酸、強堿、高溫和有機溶劑等條件非常敏感，容易失活；有機溶劑等條件非常敏感，容易失活； （2 2）不利于工業(yè)化使用不利于工業(yè)化使用：溶液中的酶很難回：溶液中的酶很難回收，提高了生產(chǎn)成本，也可

2、能影響產(chǎn)品質(zhì)量。收，提高了生產(chǎn)成本，也可能影響產(chǎn)品質(zhì)量。怎樣解決這些問題呢？怎樣解決這些問題呢？固定化酶技術(shù)固定化酶技術(shù)一、酶與固定化酶一、酶與固定化酶 酶酶 固定化酶固定化酶(固相酶固相酶)活細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物催化作用的活細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物催化作用的生物大分子。生物大分子。將將水溶性水溶性的酶用物理或化學(xué)的的酶用物理或化學(xué)的方法方法固定固定在某種介質(zhì)上，使之在某種介質(zhì)上，使之成為成為不溶于水不溶于水而又而又有酶活性有酶活性的的制劑。制劑。固定化酶的優(yōu)點固定化酶的優(yōu)點 （1 1）使酶固定化后有一定的機械強度，）使酶固定化后有一定的機械強度，催化反催化反應(yīng)的過程可應(yīng)的過程可管道化、連續(xù)化和自動化

3、管道化、連續(xù)化和自動化； （2 2）酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，）酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，產(chǎn)物更易產(chǎn)物更易純化；純化； （3 3）固定化酶可）固定化酶可反復(fù)使用，更經(jīng)濟，更利于工反復(fù)使用，更經(jīng)濟，更利于工廠化生產(chǎn)；廠化生產(chǎn)； （4 4）固定化酶提高了）固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，可較長時間酶的穩(wěn)定性，可較長時間貯存和使用；貯存和使用；固定化酶的不足之處固定化酶的不足之處不能催化一系列反應(yīng)不能催化一系列反應(yīng)二、酶的固定化二、酶的固定化 機理：機理： 將固定化酶裝柱，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過該柱時，將固定化酶裝柱，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過該柱時，在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。 方法：方法：吸附法吸附法包埋

4、法包埋法共價偶聯(lián)法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法交聯(lián)法目的目的：水溶性酶不溶于水且有酶活性水溶性酶不溶于水且有酶活性物理、化學(xué)方法物理、化學(xué)方法( (一一) )、吸附法、吸附法 吸附法是吸附法是將酶與吸附劑接觸，再經(jīng)洗滌將酶與吸附劑接觸，再經(jīng)洗滌除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最簡最簡單單的固定化技術(shù)，在的固定化技術(shù)，在經(jīng)濟上也最具有吸引力。經(jīng)濟上也最具有吸引力。1、根據(jù)吸附劑的特點分為兩種：、根據(jù)吸附劑的特點分為兩種：物理吸附法物理吸附法離子結(jié)合法離子結(jié)合法通過氫鍵、疏水鍵等作用力通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于將酶吸附于固體吸附劑固體吸附劑的的方法方法.如有機硅膠、

5、活性炭如有機硅膠、活性炭和石英砂等和石英砂等利用酶的兩性基團和離子利用酶的兩性基團和離子交換劑的相互作用（離子交換劑的相互作用（離子鍵）。吸附量大鍵）。吸附量大（二）、包埋法（二）、包埋法 是目前研究中最為活躍的方法。它的原理是是目前研究中最為活躍的方法。它的原理是酶蛋白的一些基團，在溫和的條件下與載體酶蛋白的一些基團，在溫和的條件下與載體共價結(jié)合，形成共價結(jié)合，形成共價鍵共價鍵，從而被固定化。，從而被固定化。是酶分子和多功能試劑之間形成是酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵共價鍵及酶蛋及酶蛋白的白的氨基氨基相連得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（四）、交聯(lián)法（四）、交聯(lián)法氨基相連處

6、氨基相連處.10 酶酶物理吸附法物理吸附法交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包埋法酶的固定化方法酶的固定化方法固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì) 穩(wěn)定性增加：穩(wěn)定性增加：對熱、蛋白酶及各種試劑的穩(wěn)定性對熱、蛋白酶及各種試劑的穩(wěn)定性。 pH活性曲線和最適活性曲線和最適pH的變化：的變化：可能向酸性或堿性方向移動可能向酸性或堿性方向移動。需實驗確定需實驗確定 底物的專一性變化：底物的專一性變化：三、三、-淀粉酶的固定化及淀粉酶的固定化及淀粉水解作用檢測的實驗淀粉水解作用檢測的實驗1、實驗?zāi)康模骸嶒災(zāi)康模?（1 1）制備固定化）制備固定化-淀粉酶；淀粉酶； （2 2）進行淀粉水解的測定。）進行淀粉水解的測定。2、實驗原

7、理：、實驗原理： 用用吸附法吸附法將將-淀粉酶淀粉酶固定在固定在石英砂石英砂上。一定濃上。一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成度的淀粉溶液經(jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示劑溶液（糊精。用淀粉指示劑溶液（KIKII I2 2）測試，流出物）測試，流出物呈呈紅色紅色，表明水解產(chǎn)物，表明水解產(chǎn)物糊精糊精生成。生成。枯草桿菌的枯草桿菌的-淀粉酶：淀粉酶：最適最適pH5.5pH5.57.57.5最適溫度最適溫度55557575淀粉淀粉糊精糊精麥芽糖麥芽糖葡萄糖葡萄糖-淀粉酶淀粉酶-淀粉酶淀粉酶糖化淀粉酶糖化淀粉酶遇碘顯藍(lán)色遇碘顯藍(lán)色 遇碘顯紅色遇碘顯紅色 遇碘不顯色遇碘不顯

8、色 3、設(shè)備及用品：、設(shè)備及用品： 5ml塑料注射器、塑料注射器、50ml燒杯、滴管、自行車用氣燒杯、滴管、自行車用氣門芯及夾子、注射器架、試管或微量離心管門芯及夾子、注射器架、試管或微量離心管3支支4、實驗材料及其制備、實驗材料及其制備（1 1） -淀粉酶的固定化：淀粉酶的固定化：（2 2）可溶性淀粉溶液：）可溶性淀粉溶液：（3 3）5mmol/L KI-I5mmol/L KI-I2 2溶液溶液5mg-5mg-淀粉酶淀粉酶+4ml+4ml蒸餾水蒸餾水+5g+5g石英砂，攪拌，石英砂，攪拌，30min 30min 裝入層析柱裝入層析柱1010倍體積的蒸餾水洗滌此注射器，流倍體積的蒸餾水洗滌此注

9、射器，流速為速為1ml/min1ml/min（約（約2020滴）滴）50mg50mg可溶性淀粉溶于可溶性淀粉溶于100ml100ml熱水中，攪拌均勻。熱水中，攪拌均勻。0.127g0.127g碘碘+0.83g+0.83g碘化鉀碘化鉀+ +蒸餾水蒸餾水100ml,100ml,完全溶解后完全溶解后裝入滴瓶中。裝入滴瓶中。 5、實驗步驟：、實驗步驟： 將注射器固定在注射器架上將注射器固定在注射器架上用滴管滴加淀粉溶液，流速用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（盡量慢），（盡量慢）流出流出5ml后接收后接收0.5ml（約（約10滴）流出液滴）流出液加入加入12滴滴KI-I2溶液，觀察顏色溶液，

10、觀察顏色用水稀釋用水稀釋1倍后再觀察顏色（與對照組比較）倍后再觀察顏色（與對照組比較）實驗后，實驗后，10倍柱體積蒸餾水洗滌此柱，放置在倍柱體積蒸餾水洗滌此柱，放置在4冰箱中冰箱中幾天后重復(fù)實驗，觀察結(jié)果幾天后重復(fù)實驗，觀察結(jié)果 淀粉溶液淀粉溶液+ +指示劑：指示劑： 親和層析洗脫液親和層析洗脫液+ +指指示劑：示劑： 貯于冰箱幾天后重貯于冰箱幾天后重復(fù)實驗：復(fù)實驗： 6、實驗結(jié)果：、實驗結(jié)果： 呈藍(lán)色呈藍(lán)色呈紅色呈紅色呈紅色呈紅色.16 固定化酶的用途固定化酶的用途在在工業(yè)工業(yè)上的應(yīng)用：上的應(yīng)用： 柚苷酶固定化酶用于果汁脫苦；柚苷酶固定化酶用于果汁脫苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清；木瓜

11、蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清； 葡萄糖異構(gòu)酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。葡萄糖異構(gòu)酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度。在在化學(xué)分析化學(xué)分析和和臨床診斷臨床診斷上的應(yīng)用：上的應(yīng)用： 用脲酶固定化酶測定血液或尿中的尿素含量。用脲酶固定化酶測定血液或尿中的尿素含量。 在在醫(yī)藥醫(yī)藥上的應(yīng)用：上的應(yīng)用： 將苯丙氨酸羥化酶及其輔酶制成不溶酶，注射到將苯丙氨酸羥化酶及其輔酶制成不溶酶，注射到患者體內(nèi)，可有效治療苯丙酮尿癥。患者體內(nèi)，可有效治療苯丙酮尿癥。 缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹瀉，可用乳糖酶固相酶在體內(nèi)或體外水解乳糖。腹瀉，可用乳糖酶固相酶在體

12、內(nèi)或體外水解乳糖。1 1、試驗中為什么要待固定化酶柱中流出、試驗中為什么要待固定化酶柱中流出5ml5ml液體后液體后再接收流出液用于鑒定？再接收流出液用于鑒定？討論討論 答案：因為固定化酶柱中的酶與流經(jīng)柱子的淀粉答案：因為固定化酶柱中的酶與流經(jīng)柱子的淀粉反應(yīng)需要一定的時間，剛開始流出的液體中由于反應(yīng)需要一定的時間，剛開始流出的液體中由于反應(yīng)時間過短，糊精未生成或生成的量太少，所反應(yīng)時間過短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的顏色鑒定。以不利于后面的顏色鑒定。2 2、如何證明洗滌固定化淀粉酶柱的流出液中沒有淀、如何證明洗滌固定化淀粉酶柱的流出液中沒有淀粉酶？粉酶？ 答案：可在試管中加入答

13、案：可在試管中加入1ml1ml可溶性淀粉溶液，再加可溶性淀粉溶液，再加入幾滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住試管入幾滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住試管增加溫度，幾分鐘后加入增加溫度，幾分鐘后加入1 1滴滴KI-IKI-I2指示劑，指示劑，如仍顯如仍顯藍(lán)色藍(lán)色，即流出液中沒有淀粉酶了。，即流出液中沒有淀粉酶了。 用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，作用的結(jié)果才能表明是淀液，使其自柱中流出，作用的結(jié)果才能表明是淀粉酶的固相酶作用的結(jié)果。粉酶的固相酶作用的結(jié)果。3 3、耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途？、耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途？

14、答案：在實際生產(chǎn)中，總希望反應(yīng)的時間越短越答案：在實際生產(chǎn)中，總希望反應(yīng)的時間越短越好，這就要提高反應(yīng)溫度。通常生產(chǎn)上淀粉酶是好，這就要提高反應(yīng)溫度。通常生產(chǎn)上淀粉酶是一次性使用的，加溫雖在短時間內(nèi)會使酶變性失一次性使用的，加溫雖在短時間內(nèi)會使酶變性失活，但只要使淀粉在短時間內(nèi)水解即可。活，但只要使淀粉在短時間內(nèi)水解即可。 尋找耐高溫的淀粉酶的目的是在高溫下使淀尋找耐高溫的淀粉酶的目的是在高溫下使淀粉水解快，而且酶不會因高溫而在短時間內(nèi)變性。粉水解快，而且酶不會因高溫而在短時間內(nèi)變性。在發(fā)酵生產(chǎn)中使用的往往是植物淀粉，如青霉素在發(fā)酵生產(chǎn)中使用的往往是植物淀粉，如青霉素發(fā)酵、乙醇發(fā)酵等都要水解淀粉，所以耐高溫淀發(fā)酵、乙醇發(fā)酵等都要水解淀粉，所以耐高溫淀粉酶用途廣泛。粉酶用途廣泛。.201、pH：影響載體和酶的電荷變化：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。從而影響酶吸附。2、離子強度離子強度：多方面的影響，一般認(rèn)為鹽阻止吸附。：多方面的影響，一般認(rèn)為鹽阻止吸附。3. 蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度 增加，吸附量也增加，直至飽和。增加，吸附量也增加，直至飽和。4. 溫度溫度：蛋白質(zhì)往往是