1、LOGO蛋白質的蛋白質的SDS-PAGE電泳電泳一一.實驗目的實驗目的學習學習SDS-PAGE測定蛋白質分子量的原理。測定蛋白質分子量的原理。掌握垂直板電泳的操作方法。掌握垂直板電泳的操作方法。二二.實驗原理實驗原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)(Acr)和交聯劑和交聯劑N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺(Bis)(Bis)在加速在加速劑劑N N，N N，N N ，N N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和催和催化劑過硫酸銨化劑過硫酸銨(AP)(AP)或核黃素的作用下聚合交或核黃素的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此

2、凝膠為支持聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(PAGE)。 分子量范圍與凝膠濃度的關系分子量范圍與凝膠濃度的關系 丙烯酰胺濃度（丙烯酰胺濃度（% %）線性分離范圍（線性分離范圍（kDkD）1515121243431010161668687.57.5363694945.05.05757212212 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGESDS-PAGE） ：蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。決于它所

3、帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統中加入陰離子去污劑十如果在丙烯酰胺凝膠系統中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉二烷基磺酸鈉(SDS)(SDS)，則蛋白質分子的電泳遷移率，則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關。因此可以利用關。因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE測定蛋白質分子量。測定蛋白質分子量。 當蛋白質的分子量在當蛋白質的分子量在15KD15KD200KD200KD之間時，電之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。 凝膠由分離膠和濃縮膠組成：凝膠由分離

4、膠和濃縮膠組成： 上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有上層為濃縮膠，凝膠孔徑較大，沒有分子篩效應，其分子篩效應，其pHpH為為6.86.8，由于快慢離子所，由于快慢離子所形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質分子在形成的高電壓梯度，使得變性蛋白質分子在泳動中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分泳動中被壓縮為很薄的一層，大大提高了分辨率。辨率。 下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分下層為分離膠，凝膠孔徑較小，有分子篩效應，子篩效應，pHpH為為8.88.8，變性蛋白質分子所帶，變性蛋白質分子所帶負電荷基本一致，泳動速度主要決定于分子負電荷基本一致，泳動速度主要決定于分子量。量。電泳過程中分子遷移的規律，小分子走在

5、前頭，大分子滯后電泳過程中分子遷移的規律，小分子走在前頭，大分子滯后混合樣品混合樣品帶孔膠帶孔膠按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向電泳電泳小分子小分子大分子大分子三三.實驗試劑和器材實驗試劑和器材1.材料：材料：標準蛋白標準蛋白2.試劑：試劑： (1)30%丙烯酰胺丙烯酰胺(2)10%SDS(3)分離膠緩沖液分離膠緩沖液:1.5mol/LTris-HClpH8.8(4)濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液:0.5mol/LTris-HClpH6.8試劑：試劑：(5) 10%(5) 10%過硫酸銨過硫酸銨(APS)(APS)溶液溶液 (6) (6) 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEME

6、D)(7) SDS(7) SDS上樣緩沖液上樣緩沖液: :Tris-HClTris-HCl、 SDSSDS、溴酚藍、甘、溴酚藍、甘油、油、 2-2-巰基乙醇巰基乙醇 (8) (8) 電極緩沖液電極緩沖液（Tris-Tris-甘氨酸緩沖液）甘氨酸緩沖液）(9) (9) 染色液染色液: :甲醇、水甲醇、水 、冰乙酸、冰乙酸 、考馬斯亮藍、考馬斯亮藍R250 R250 (10) (10) 脫色液脫色液: :甲醇、水甲醇、水 、冰乙酸、冰乙酸 3.3.實驗器材：實驗器材：垂直板電泳裝置垂直板電泳裝置穩壓穩流電泳儀穩壓穩流電泳儀 脫色搖床脫色搖床移液槍移液槍濾紙濾紙 大培養皿大培養皿各部分凝膠配制各部分

7、凝膠配制分離膠分離膠(10% 10ml)(10% 10ml)濃縮膠濃縮膠(5% 10ml)(5% 10ml)ddHddH2 2O O4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-HCl 1.25ml10%SDS10%SDS100100l l100100l l10%Ap10%Ap5050l

8、l100100l lTEMEDTEMED1010l l1010l l四四.實驗步驟實驗步驟1.安裝制膠模具。安裝制膠模具。2.調制分離膠（調制分離膠（10%），加入），加入10%APS和和TEMED，混勻，立即灌注至模具高度的，混勻，立即灌注至模具高度的70%。3.加一層純水，約加一層純水，約30min后聚合。后聚合。4.倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干。倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干。5.調制濃縮膠（調制濃縮膠（5%），加入），加入10%APS和和TEMED混勻，立即灌注插入梳子。靜置混勻，立即灌注插入梳子。靜置40min。出現明顯界面時，出現明顯界面時，分離膠凝聚完成分離膠凝聚完成（ min

9、h）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用濾紙吸干并用濾紙吸干v制備分離膠制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。加入濃縮膠溶加入濃縮膠溶液液 pH6.8v制備濃縮膠制備濃縮膠樣梳需一次平穩插入樣梳需一次平穩插入,梳梳口處不得有氣泡口處不得有氣泡,梳底需梳底需水平。水平。插入樣品梳插入樣品梳6.樣品及標準品的準備：標準品按說明書進樣品及標準品的準備：標準品按說明書進行處理，樣品加入行處理，樣品加入ddH2O溶解后，再加入溶解后，再加入SDS上樣緩沖液。上樣緩沖液。7.加樣電泳（每孔加樣加樣電泳（每孔加樣15l）。開始）。開始8V/cm（

10、60V），染料進入分離膠時，電壓提到），染料進入分離膠時，電壓提到15V/cm（110V），繼續電泳，讓溴酚藍到），繼續電泳，讓溴酚藍到達分離膠底部時關閉電源。達分離膠底部時關閉電源。8.卸下玻板，剝離凝膠放在器皿內，切去一卸下玻板，剝離凝膠放在器皿內，切去一角作為方位標記。角作為方位標記。v上樣及電泳上樣及電泳9. 9. 染色：用至少五倍體積染色液浸泡凝膠，染色：用至少五倍體積染色液浸泡凝膠，于平緩搖擺平臺上室溫于平緩搖擺平臺上室溫1h1h左右。左右。10.10.脫色：用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色：用蒸餾水漂洗數次，再用脫色液脫色，至蛋白質條帶清晰。脫色，至蛋白質條帶清晰。注意事項注意事

11、項（1）安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。螺絲，防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。（2）凝膠配制過程要迅速凝膠配制過程要迅速, , 催化劑催化劑TEMEDTEMED要在要在注膠前再加入注膠前再加入, ,否則凝結無法注膠。注膠過否則凝結無法注膠。注膠過程最好一次性完成程最好一次性完成, ,避免產生氣泡。避免產生氣泡。（3）梳子需一次平穩插入梳子需一次平穩插入, ,梳口處不得有氣泡梳口處不得有氣泡, ,梳底需水平。梳底需水平。（4）微量注射器（加樣器）上樣時微量注射器（加樣器）上樣時, , 注射器注射器不可過低不可過低, ,以防

12、刺破膠體；也不可過高以防刺破膠體；也不可過高, , 樣樣品下沉時易發生擴散，溢出加樣孔。品下沉時易發生擴散，溢出加樣孔。（5）剝膠時要小心剝膠時要小心, ,保持膠完好無損保持膠完好無損, ,染色要染色要充分。充分。（6 6）聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴）聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時要戴手套。手套。 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選Tris/HCL緩沖液，電級液選Tris/甘氨酸。電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子