1、ICS 11.22053CCS B 41云南省地方標準DB53/T 1064.22021綠孔雀檢疫技術 第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術規范Quarantine technique for Pavo muticusPart 2: Technical specifications for laboratory examination ofAvian Influenza Virus2021 - 09 - 30 發布2021 - 10 - 14 實施云南省市場監督管理局發 布學兔兔 標準下載DB53/T 1064.22021目次前言III引言1 范圍12 規范性引用文件13 術語和定義14 縮

2、略語25 總則26 禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型27 儀器設備和試劑37.1 實驗室器材37.2 試劑38 樣品38.1 采樣要求與原則38.2 采樣類型和采樣方法38.3 樣品儲運49 試驗步驟49.1 樣品制備49.2 雞胚接種49.3 MDCK 細胞培養49.4 病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗59.5 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增檢測59.6 H 蛋白序列分析710 試驗數據處理710.1 HA 試驗結果判定710.2 HI 試驗結果判定710.3 核酸檢測結果判定8附錄 A（規范性）緩沖溶液和 1%雞紅細胞懸液9附錄 B（資料性）采樣記錄表10IDB53

3、/T 1064.22021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規則的規定起草。本文件是DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術的第2部分。DB53/T 1064已經發布了以下部分：第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術規范；第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術規范；第 3 部分：羽虱實驗室檢測技術規范；第 4 部分：消化道線蟲實驗室檢測技術規范。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。 本文件由云南省林業與草原局、云南省市場監督管理局共同提出。本文件由云南省林業標準化技術委員會（YNTC02）歸口。 本文件主要

4、起草單位：云南農業大學、云南省標準化研究院。本文件主要起草人：陳培富、黃艷梅、卓娜、李建春、胡世享、楊俊、錢麗敏、何依蓉、鄒豐才、楊建發。IIIDB53/T 1064.22021引言綠孔雀（Pavo muticus）在我國僅分布于云南，是國家級重點保護野生動物，也是全球瀕危物種， 并已列入瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)和世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄。為切實貫徹中華人民共和國野生動物保護法和中華人民共和國動物防疫法，編制并發布DB53/T 1064綠孔雀檢疫技術地方標準，可讓從事綠孔雀保護的相關人員按標準化和規范化程序開展綠孔雀病原學診斷，從而采取必要的防治措施，以提高染疫綠孔雀

5、的成活率，維護綠孔雀種群健康和地區生態平衡， 提升生物多樣性保護成效。本文件已發布4個部分：第 1 部分：禽副黏病毒實驗室檢測技術規范。本部分從禽副黏病毒實驗室檢測技術的總則、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規范；第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術規范。本部分從禽流感病毒實驗室檢測技術的總則、禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方 面制定了規范；第 3 部分：羽虱實驗室檢測技術規范。本部分從羽虱實驗室檢測的原理、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規范；第 4 部分：消化道線蟲實驗室檢測技術

6、規范。本部分從消化道線蟲實驗室檢測技術的試驗原理、常見線蟲形態特征、試驗條件、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟、試驗數據處理等方面制定了規范。DB53/T 1064.22021綠孔雀檢疫技術第 2 部分：禽流感病毒實驗室檢測技術規范重要提示：由于禽流感病毒可感染人類，采樣和檢測人員應穿戴防護服及口罩，并采取必要的消毒 措施。涉及禽流感病毒的實驗操作，應在相應的生物安全級別實驗室（符合GB 19489的要求）進行。本檢測技術規范中凡接觸病毒樣品的檢驗器材、廢棄物及其包裝物均應做消毒或滅菌等無害化處理，以免 污染環境或擴散病毒。1 范圍本文件規定了綠孔雀（Pavo muticus）檢疫技術中禽流感病

7、毒實驗室檢測技術的總則、禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型、儀器設備和試劑、樣品、試驗步驟和試驗數據處理。本文件適用于綠孔雀檢疫技術中禽流感病毒實驗室檢測。2 規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，標注日期的引用文 件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不標注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適 用于本文件。GB 19489 實驗室 生物安全通用要求NY/T 541 獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范3 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1禽流感 avian influenza禽流感是由正粘病毒科（Orthomyxovirida

8、e）甲型流感病毒屬（Influenzavirus A）成員引起禽類的一種急性、全身出血性傳染病。3.2病毒血凝 viral hemagglutination具有血凝活性的病毒（如流感病毒）粒子，憑借其表面的血凝素識別、結合特定動物紅細胞表面受 體并使紅細胞凝集（即紅細胞不再自然下沉匯集）。3.3病毒血凝抑制 viral hemagglutination inhibition抗體特異性結合于具有血凝活性的病毒粒子的血凝素（H）抗原位點，干擾病毒H蛋白與紅細胞受體之間的結合，從而阻斷或抑制病毒粒子凝集紅細胞的能力。3.4反轉錄-聚合酶鏈式反應 reverse transcription - pol

9、ymerase chain reaction1DB53/T 1064.22021以RNA（mRNA）為模板，經逆轉錄酶催化生成 cDNA，再以cDNA為模板進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，常用于獲得目的基因或檢測mRNA表達。3.5弗林蛋白 furin亦稱作成對堿性氨基酸裂解酶，是動物細胞產生的內切蛋白酶，能識別、裂解流感病毒血凝素（H） 蛋白中存在的R-X-X-R位點，產生H1和H2兩個亞基，以形成具有感染活性的流感病毒粒子。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。AIV：禽流感病毒 Avian influenza virusAMV：禽成髓細胞瘤病毒 Avian myeloblastosis v

10、irusDEPC：焦碳酸二乙酯 DiethypyrocarbonatedNTP：脫氧核苷酸 Deoxyribonucleotide triphosphate H：血凝素 HemagglutininHA：血凝 HemagglutinationHAU：血凝單位 Hemagglutination unitHEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HI：血凝抑制 Hemagglutination inhibitionHPAI：高致病性禽流感 Highly pathogenic avian influenza

11、M：基質蛋白 Matrix proteinMDCK：犬腎傳代細胞 Madin-Darby kidney cells N：神經氨酸酶 NeuraminidasePBS：磷酸緩沖鹽溶液 Phosphate-buffered saline PCR：聚合酶鏈式反應 Polymerase chain reaction RBCs：紅細胞 Red blood cellsRNA：核糖核酸 Ribonucleic acidRT-PCR：反轉錄-聚合酶鏈式反應 Reverse transcription - polymerase chain reaction SPF：無特定病原體 Specific pathoge

12、n free5 總則5.1 雞胚接種和MDCK細胞培養均是分離禽流感病毒的有效方法，檢測流感病毒時，根據具體情況選用其一，或同時采用。5.2 取5.1收獲的尿囊液或MDCK細胞培養物上清做HA試驗和HI試驗，確定分離毒株的種屬及血清型（亞型）。5.3 對5.1或5.2分離毒株采用RT-PCR擴增分析其M基因，做出禽流感病毒定性鑒定。5.4 對5.2確定的禽流感病毒H5、H7或H9血清亞型的分離毒株，用血清亞型特異性引物做RT-PCR擴增 檢測其H基因，并依據H基因測序結果判定分離毒株的致病性程度。6 禽流感病毒毒株的毒力劃分和血清亞型2DB53/T 1064.22021根據禽流感病毒致病性或毒

13、力的不同，可以將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。已知流感病毒可分為18個H亞型和11個N亞型。其中，由H5和H7亞型毒株（以H5N1和H7N7 為代表）引起的禽流感通常為HPAI，其傳染性強，死亡率高、危害大。7 儀器設備和試劑7.1 實驗室器材PCR儀、凝膠成像系統、臺式低溫高速離心機、電泳儀、電泳槽、冰箱、微量移液器、水浴鍋、照 膠儀、手術器械、棉拭子、離心管、抗凝管、一次性濾器（濾膜孔徑0.45 m）、細胞培養瓶、V形孔血凝反應板、微型振蕩器等。7.2 試劑RNA提取試劑或試劑盒、氯仿、異丙醇、75%乙醇、1.0%瓊脂糖凝膠、阿氏液（Alsevers solut

14、ion）（見附錄A.1）、1% 雞紅細胞懸液（見附錄 A.2）、0.01 mol/L PBS（pH 7.2）、核酸染料、標準禽流感病毒抗原與參考毒株、陽性對照血清、陰性對照血清、MDCK 細胞、DMEM 培養基、青霉素、鏈霉素、HEPES、胰蛋白酶、引物、10×擴增反應緩沖液、dNTPs（每種核苷酸2.5 mmol/L）、瓊脂糖、核酸上樣緩沖液、膠回收試劑盒等。8 樣品8.1 采樣要求與原則8.1.1 采樣要求采樣應符合 NY/T 541 的要求。8.1.2 采樣原則采集的樣品應具有典型性，從瀕死、死亡或處于急性發病期的綠孔雀采集樣品，對暴發疫病的群體 宜采集多只發病或死亡綠孔雀的樣

15、品。采樣過程應無菌操作，裝樣品的容器應確保密封完好，注意避免 被污染以及污染環境，并及時填寫采樣記錄表（見附錄 B），確保樣品編號與標簽一致。8.2 采樣類型和采樣方法8.2.1 口咽拭子和泄殖腔拭子采樣方法如下：a) 取咽喉拭子時，將拭子深入孔雀喉頭口及上顎裂來回刮 3 次5 次取咽喉分泌液；b) 取泄殖腔拭子時，將拭子深入孔雀泄殖腔轉一圈并沾取少量內容物；c) 同一個體的咽喉拭子和泄殖腔拭子合并放入預先盛有 1.0 mL PBS（含 100 IU/mL 青霉素和 100 g/mL 鏈霉素）的離心管中，蓋緊管蓋，并對樣品編號。8.2.2 組織樣品若綠孔雀死亡在 24 h 以內，則適合采集組織

16、樣品。每只綠孔雀采集肺（或氣管）、腦、心、肝、脾、胃、腎等組織各 1 份，數量均宜不少于 3 g。待檢樣品裝入一次性密封袋或其它滅菌容器，確保密封完好，編號，送實驗室。3DB53/T 1064.220218.2.1血清每只孔雀采集靜脈血 2 mL3 mL，盛于無菌器皿中或 10 mL 離心管中，37 靜置 1 h 或 4 靜置 3 h4 h，經 2 000 r/min3 000 r/min 離心 15min 分離血清，將血清移、分裝于新的無菌離心管，蓋緊，封好管口，貼上標簽。剛死亡的綠孔雀可用無菌注射器從其心臟采血，直接轉移至無菌離心管中，密封，編號，同法分離 血清。8.3 樣品儲運8.3.1

17、 口咽及泄殖腔拭子拭子樣品在 4 條件下保存不應超過 24 h，若長期保存，應置于80 冰箱。8.3.2 組織樣品組織樣品應冰凍（20 以下）保存和運輸，且不能反復凍融。8.3.3 血清一周內做檢查的血清可置 4 冰箱保存。若長時間保存，應將血清放入20 或80 冰箱凍存。9 試驗步驟9.1 樣品制備9.1.1 口咽及泄殖腔拭子用經滅菌的鑷子將拭子中的液體充分擠出，混勻樣品，直至拭子上沒有肉眼可見的樣品，室溫放置30min，4 3 000 r/min離心15min，轉移上清液于1.5 mL無菌離心管內，編號備用。9.1.2 組織樣品取適量待檢樣品置于潔凈、滅菌并烘干的研缽中，加入液氮充分研磨。

18、按1 g 組織樣品加10 mL PBS的比例混勻，4 3 000 r/min離心15min，取上清液轉入1.5 mL 無菌離心管內，編號，備用。9.2 雞胚接種9.2.1 樣品處理取9.1得到的上清液過濾，濾過液作為接種材料。9.2.2 樣品接種取9.2.1樣品，以0.2 mL/胚劑量經尿囊腔途徑接種9 d11 d SPF雞胚，每個樣品接種35枚雞胚， 封閉進針孔，在37 孵化箱內孵育，每隔12 h觀察雞胚死亡情況。無菌收集24 h96 h死亡雞胚及96 h 仍存活雞胚的尿囊液，采用HI試驗測定尿囊液有無HA活性。9.3 MDCK 細胞培養具體操作步驟如下：4DB53/T 1064.22021

19、a) 將樣品濾過液接種于長成致密單層的 MDCK 細胞瓶內，置于 35 37 、含 5% CO2 培養箱內培養，使病毒吸附細胞 2 h；b) 棄掉樣品液，用 DMEM 維持液（含 3%犢牛血清）洗一遍，每瓶加入 5 mL DMEM 維持液， 置于 35 37 、5% CO2 培養箱內培養。維持液成份：DMEM 培養基，青霉素、鏈霉素、HEPES、胰酶終濃度分別為 100 IU/mL、100 g/mL、25 mmol/L 和 2 g/mL，用 NaHCO3 將pH 值調整為 7.2，過濾除菌，無菌檢驗合格；c) 逐日在倒置顯微鏡下觀察細胞病變，分別取陰性對照、未出現病變的和出現病變的細胞培養物

20、上清液，用 HA 試驗測定病毒的血凝滴度（效價）；d) 當 75%100%細胞出現病變時收獲病毒，將細胞瓶放于70冰箱，凍融 12 次以使細胞破裂及釋放病毒。9.4 病毒血凝（HA）試驗和血凝抑制（HI）試驗9.4.1 病毒血凝（HA）試驗病毒血凝（HA）試驗方法：a) 在 96 孔 V 型微量反應板，每孔預先加 25 L PBS；b) 向第 1 孔加入 25 L 病毒溶液（尿囊液或細胞培養物上清），反復吹吸 3 次5 次混勻；c) 從第 1 孔吸取 25 L 病毒溶液加入第 2 孔，混勻后吸取 25 L 加入第 3 孔，如此進行 2 倍連續稀釋至第 11 孔，從第 11 孔吸取 25 L 溶

21、液棄去，但第 12 孔加入 25 L PBS 或正常尿囊液作為陰性對照孔；d) 每孔加入 25 L PBS；e) 每孔加入 25 L 1%雞紅細胞懸液；f) 輕輕振蕩血凝反應板以混勻反應體系，室溫（20 25 ）靜置 40min，或 4 靜置 60min， 當陰性對照孔的紅細胞在孔底匯集成原點時判定結果。9.4.2 病毒血凝抑制（HI）試驗病毒血凝抑制（HI）試驗方法：a) 在 96 孔血凝反應板，每孔預先加入 25 L PBS；b) 向第一孔加入 25 L 血清樣品，混勻；c) 在血凝反應板上將血清作橫向的 2 倍連續稀釋，但第 12 孔、第 13 孔、第 14 孔和第 15 孔分別設置為加

22、 25 L PBS 的紅細胞對照孔、加未做任何免疫禽血清的陰性對照孔、加新城疫病毒抗體的對照孔和加禽腺病毒抗體的對照孔（對已確定禽流感病毒血清亞型的分離毒株，還可設置 陽性對照孔）；d) 每孔加入 25 L 4 HAU 的病毒抗原，室溫（20 25 ）靜置不少于 30min，或 4 靜置不少于 60min；e) 每孔加入 25 L 1 %RBCs，輕輕振蕩混勻，室溫（20 25 ）靜置約 40min，或 4 放置約 60min，當紅細胞對照孔呈顯著鈕扣狀時判定結果。9.5 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）擴增檢測9.5.1 病毒 RNA 的提取可用商品化RNA提取試劑盒提取待檢樣品（棉拭

23、子、組織或雞胚尿囊液）、陽性對照樣品及陰性對照樣品的病毒RNA。也可用RNA提取試劑（如Trizol）提取，方法如下：a) 將經預處理的 250 L 待檢樣品加入 750 L RNA 提取試劑中，振蕩 2min，室溫放置 5min；5DB53/T 1064.22021b) 加入 250 L 氯仿，在微型振蕩器上振蕩 1min，室溫放置 5min，4 、12 000 r/min（約 14 000×g）離心 15min；c) 轉移上層水相至新離心管中，加入等量的異丙醇，充分混勻，室溫放置 15min，4 條件下12 000 r/min（約 14 000×g）離心 15min；d

24、) 小心吸棄上清，加入預先經 DEPC 處理的 75%乙醇 750 L，4 、12 000 r/min（約 14 000×g） 離心 5min；e) 小心吸棄上清，將沉淀自然風干或于 50 烘干，加適量的經 DEPC 處理的超純水溶解；f) 取 5 L 提取物與 1 L 6×核酸上樣緩沖液混勻，做 1%瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 提取效果， 對組織樣品觀測到 28S、18S 及 5.8S rRNA 三個條帶或至少前兩個條帶，提示 RNA 提取合格；g) 提取的 RNA 應在 2 h 內進行 RT 或 RT-PCR 擴增，若需長期保存 RNA，應置于80 冰箱或液氮內。9.5

25、.2 RT-PCR 擴增（一步法）取提取的 RNA 3 L 和每對引物（見表 1）各 1 L，配制 RT-PCR 擴增體系（見表 2），蓋緊 PCR反應管蓋子，置于 PCR 儀器反應孔內。擴增參數：45 逆轉錄 45min；94 預變性 2min，94 變性 30s、52 退火 45s、68 延伸 45s，35 個循環，最后 68 延伸 8min。對擴增任何亞型的 H 基因（Hx）中包含 Furin 酶切位點的片段，按模板 RNA 5 L，上、下游引物組合（見表 1）各 1 L 配制 RT-PCR 反應體系。擴增參數除退火溫度設置為 50 ，其余參數不變。表 1禽流感病毒 PT-PCR 引物目

26、的基因引物名稱引物序列 53擴增產物長度（bp）MM-229UTTC TAA CCG AGG TCG AAA C229M-229LAAG CGT CTA CGC TGC AGT CCH5H5-372UGGA ATA TGG TAA CTG CAA CAC CA369H5-372LAAC TGA GTG TTC ATT TTG TCA ATGH7H7-501FAAT GCA CAR GGA GAG GGA ACT501H7-501RTGA YGC CCC GAA GCT AAA CCAH9H9-273FTGT GTC TTA CAG TGG GAC AAG CA273H9-273RTTG ACA

27、 AGA GGC CTT GGT CCT ATHxHA-1057.1-F HA-1057.2-FHA-1057.3-FGGR GAA TGC CCC AAA TAY GT GGR ARA TGC CCC AGR TAT GTGGR GAA TGC CCC AAR TAY AT164176HA-1232.1(555)-RHA-1232.2(555)-RCTG AGT CCG AAC ATT GAG TTG CTA TGV TGR TAW CCA TAC CACTG AGT CCG AAC ATT GAG TTY TGA TGYCTG AAD CCR TAC CA注：R=(A/G)，Y=(C/T)

28、，W=(A/T)；斜體字母表示非病毒序列6DB53/T 1064.22021表 2RT-PCR 擴增體系組分體積（L）無 RNA 酶滅菌超凈水14.610×擴增反應緩沖液2.5dNTPs（2.5 mmol/L each）2.0RNase 抑制劑（40 U/L）0.5AMV 反轉錄酶（5 U/L）0.7Taq DNA 聚合酶(5 U/L)0.7上游引物 P1（20 mol/L)0.5下游引物 P2 (20 mol/L)0.5模板 RNA3.0總計25.09.5.3 電泳取PCR產物按常規方法用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢查（電壓8 V 10 V/cm凝膠長度，30min 40min）。9.

29、5.4 照膠用凝膠成像系統在紫外光下進行拍照凝膠，記錄PCR擴增結果。9.6 H 蛋白序列分析取HA滴度陽性，新城疫病毒抗體和禽腺病毒抗體HI滴度陰性的雞胚尿囊液或MDCK細胞培養物上清，按9.5提取總RNA做H基因的RT-PCR擴增。出現對應表1所示擴增產物大小的H5亞型369 bp條帶或Hx亞型164 bp176 bp條帶，參照膠回收試劑盒方法回收條帶內的擴增產物，做雙向核酸測序；根據基因序列推導氨基酸序列，對禽流感病毒H蛋白的Furin酶切位點進行堿性氨基酸數量和位置的分析。10 試驗數據處理10.1 HA 試驗結果判定判定如下：a) 將血凝反應板傾斜 60 ，觀察紅細胞有無淚珠樣流淌，

30、完全無淚珠樣流淌（出現 100%凝集） 的病毒最高稀釋倍數判為該病毒的血凝效價，即代表 1 個 HAU；b) 血凝判定標準：紅細胞均勻分散在孔內、傾斜血凝反應板時不流淌判為完全凝集，記作+； 75%凝集記作+；50%凝集記作+；25%凝集記作+；紅細胞匯集于孔底中央呈圓點、傾斜血凝反應板時與對照孔（僅含 25 L RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定為不凝集，記作。10.2 HI 試驗結果判定判定如下：7DB53/T 1064.22021a) 紅細胞均勻分散在孔底周圍、傾斜血凝反應板時不流淌判為完全凝集，記作+，75%凝集記作+，50%凝集記作+，25%凝集記作+，紅細胞

31、集中在孔底中央呈圓點、傾斜血凝反應板時與對照孔（僅含 25 L RBCs 和 50 L PBS）RBCs 流淌相同的孔判定為不凝集或血凝被抑制，記作；b) 完全抑制 4 HAU 病毒抗原的血清最高稀釋倍數為該血清抗體的 HI 滴度；c) 檢查各種對照：陰性對照血清 HI 滴度不高于 4 (22 或 2 log2)，陽性對照血清 HI 滴度與已知滴度誤差不超過 1 個滴度，紅細胞對照無自凝現象，結果有效，試驗成立；d) 如果高于 1:16（24 或 4 log2）稀釋度的血清能完全抑制 4 HAU 的病毒抗原，判定該 HI 滴度為陽性，表明未經免疫個體發生禽流感病毒感染；e) 如果血清 HI 滴度為 16，判為可疑，需重復 HI 試驗，若 HI 滴度仍為 16，可判定血清抗體陽性，若 HI 滴度為 8 則判定為血清抗體陰性；f) 在所有的確診試驗中針對試驗采用的 HAU 應設病毒 HA 滴度的追溯性測