1、酪氨酸酶的提取及其酶促反應動力學研究一、實驗目的1.認識生物體中酶的存在，了解生物體系中酶促反應的特點；2.了解底物濃度對酶促反應速度的影響；3.了解抑制劑對酶促反應速度的影響；4.掌握用雙倒數作圖法求米氏常數；5.實驗擬通過從土豆等物中提取酪氨酸酶并就其酶促反應的動力學研究其活性。二、實驗原理v影響酶促反應速度的因素：v酶的濃度Ev底物的濃度Sv溶液的pH值v溫度v酶的抑制劑v酶的激活劑酶催化劑的特點v1.具有表觀活性和專一性所需要的結構空間，反應能在比較溫和的條件下進行；v2.酶促反應的活化能較低；v3.酶的催化效能極高；v4.酶具有高度的專一性。一、底物濃度對酶促反應的影響v隨反應物濃度

2、S的增大，酶促反應速度V增大。當底物的濃度較低時，V隨S增大而急劇增大，二者成正比關系；隨著S的繼續增大，V繼續增大，而增幅逐漸減小，若再繼續增大S，則V將不再變化，v達到一個極v限值Vmax。酪氨酸酶對多巴的催化氧化原理v影響酶作用的因素：酶的濃度、底物濃度、溶液的pH值、和酶抑制劑等。v米氏方程vS、E分別為底物濃度和酶的濃度，km為米氏常數，其物理意義是當酶促反應速度到達最大速度一半時的底物濃度，單位mol/Lv對米氏方程進行雙倒數得到：v以1/v為縱坐標，1/S為橫坐標作圖，由圖得到截距和斜率，即可計算vmax和Km。儀器與試劑v儀器：分光光度計植物組織搗碎機離心機恒溫水浴v試劑：pH

3、6.8磷酸鹽緩沖溶液多巴溶液（200mg/L）銅試劑（10-3mol/L） 土豆實驗步驟v1.絡氨酸酶的提取：取75g的去皮土豆，切碎，置于植物組織搗碎機中，加入冷卻的磷酸鹽緩沖溶液150ml，在高速轉速下搗碎2分鐘，然后倒入干凈燒杯中靜置2分鐘，去上層清液于離心式管中在3000r/min轉速下離心分離5分鐘。v2.Km和vmax的測定：在6支比色管中按表1加入緩沖溶液、多巴溶液，搖勻、30恒溫10min，再在00、0、1號比色管各加入絡氨酸酶提取液各0.20mL，搖勻后立即倒入比色皿中，以00號為參比溶液，測量其吸光度，前5min每隔30s測量一次溶液的吸光度，后5min每隔60s測量一次溶

4、液的吸光度，并記錄溶液的吸光度和對應反應時間。以同樣方法測量2-5號溶液的吸光度并記錄數據。v3.抑制劑的影響：按表2的所列的數據進行溶液的配制，以0號溶液為參比溶液，按步驟2的方法測量各個溶液的吸光度隨時間的變化。數據記錄表1項目00012345緩沖溶液4.83.83.83.32.82.31.8多巴溶液0.01.01.01.52.02.53.0酶提取物0.20.20.20.20.20.20.2數據記錄表2項目012345緩沖溶液4.62.62.52.42.32.2多巴溶液02.02.02.02.02.0銅試劑000.10.20.30.4酶提取物0.40.40.40.40.40.4數據記錄及處理時間0吸光度濃度12345時間1吸光度濃度2345v1.根據朗伯-比爾定律，將測得的吸光度計算轉化為濃度，以濃度為縱坐標，時間為橫坐標作圖，求得直線的斜率即為反應的速度v；v2.根據雙倒數米氏方程，以1/v為縱坐標，1/S為橫坐標作圖，求得直線的截距和斜率即可計算反應的最大速度vmax和米氏常數Km；v3.抑制劑的影響：求出未加入和加入抑制劑的反應速度，以反應速度為縱坐標，抑制劑濃度為橫坐標作圖，判斷抑制