1、Optogenetics Optogenetics School of Life Science, PKU光遺傳學及光學在其中的應用光遺傳學及光學在其中的應用Photo courtesy: Nature ViodeoOpto: related with opticsGenetic: Expression, regulation of genesPhoto courtesy: Nature ViodeoAndNeuroscience.tw/neuroscience/Single-component optogenetics 單單組分光遺傳學組分光遺傳學19

2、79，Francis Crick提出： 神經生物學主要挑戰控制腦中一種神經細胞，而使其他細胞保持不變。神經元的激活或者抑制行為的變化行為的獲得或者缺失 神經元的變化復雜病理機制的研究阿茲海默癥PET scanning 視蛋白視蛋白(Opsins)的發現的發現1971，Stoeckenius and Oesterhelt發現細菌視紫紅質在光激發下有離子泵的作用；1977，Matsuno-Yagi and Mukohata發現鹽細菌視紫紅質；光照激發- 離子泵活動- 動作電位、神經沖動Stoechkenius et al, 1971離子通道與動作電位離子通道與動作電位動作電位與離子通道 神經細胞膜

3、電位為負； 膜內外離子濃度不同； 去極化膜電位上升，超極化膜電位下降； 動作電位與離子進出相關Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光遺傳學未應用于神經學光遺傳學未應用于神經學 外源蛋白質對脆弱的神經元造成傷害； 光電流太微弱、速度慢； 不滿足Single-component strategy視蛋白的作用需要一個共同作用因子 all-tans retinal（全反式視黃醛）視蛋白與離子通道視蛋白應用于神經生物學開端視蛋白應用于神經生物學開端2005年8月， Karl Deisseroth課題組發表報告： 在神經元中只導

4、入視蛋白基因，而無其他化學物質導入，使得神經元在光照刺激下發生反應。 脊椎動物組織中有視黃醛，光控效果理想視黃醛結構Karl Deisseroth 1971 born， B.A. Biochemistry, Harvard; M.A. & Ph.D. Neuroscience, Standford; Creating CLARITY & optogenetics135光光遺傳學領域的研究工作發展遺傳學領域的研究工作發展Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience Keyword: bacteriorhodop

5、sin Keyword:optogenetics135細菌視紫紅質19711971鹽細菌視紫紅質1977,19821977,1982視紫紅質通道蛋白1984,1991,20021984,1991,2002三種重要視蛋白的發現Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光光遺傳學領域的研究工作發展遺傳學領域的研究工作發展135細菌視紫紅質在神經元和線蟲行為獲得中應用，20052005神經元與光纖的接觸，光基因學在線蟲行為缺失、哺乳動物行為獲得中的應用，20072007通過軸突投射和重組酶實現的行為控制，閉環光基因學，20092

6、009視蛋白Opsin在神經學研究中的應用和設備發展Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光光遺傳學領域的研究工作發展遺傳學領域的研究工作發展 2010年Optogenetics被評為Nature年度技術，此后領域內跟進大量研究 光學 微電子 蛋白質工程 神經生物學Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience2010Nature2010Nature年度技術年度技術l光遺傳學的由來與神經生物學研究l視蛋白的發現、離子泵作用l神經學家渴求的單組分研究工具

7、l光遺傳學的發展進程l光遺傳學的具體研究l光遺傳中光學的作用以及待解決的問題光遺傳學光遺傳學光遺傳學光遺傳學l光遺傳學的由來與神經生物學研究l光遺傳學的具體研究l視蛋白的原理和開發l光遺傳神經生物學研究過程l光遺傳中光學的作用以及待解決的問題Optogenetics: controlling cell function with light, Nat. Method,2011視蛋白與神經細胞動作電位視蛋白與神經細胞動作電位激活型通道：陽離子自由進出，去極化更容易；抑制型通道：氫離子外流，或氯離子內流，膜電位超極化；激活和抑制疊加2012 Hideaki Kato et al視蛋白離子泵作用原理

8、視蛋白離子泵作用原理結構與功能光照結構域光譜吸收構象變化特定離子沿梯度進出X射線衍射得到ChR感光部分的結構細菌視紫紅質H+泵示意圖Inbal Goshen et al, Cell, 2011視蛋白家族視蛋白家族光遺傳學神經研究的重要工具 視蛋白的光譜、峰值、半衰期數據方法方法：位點突變（蛋白質工程），基因組掃描 Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neurosciencePhoto courtesy, Guoshen, Stanford光遺傳學光遺傳學l光遺傳學的由來與神經生物學研究l光遺傳學的具體研究l視蛋白的原理和開發l光遺傳神經生物

9、學研究過程l光遺傳中光學的作用以及待解決的問題Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience, Nat.Neuronsci.,2015光遺傳學神經研究過程光遺傳學神經研究過程視蛋白基因轉入視蛋白基因轉入腺病毒轉染視蛋白基因過程 通過腺病毒在神經細胞中導入視蛋白基因 Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience光纖插入與顱頂固定光纖插入與顱頂固定兼給藥和光線插入視蛋白注入點和光照區域的吻合改進：加轉動關節，便于實驗動物運動；固定光纖和金屬片，減少對神經組織的傷

10、害，減小動物壓力光纖裝置示意圖Optogenetics: 10 years of microbial opsinsin neuroscience視蛋白激發或者抑制動作電位效果驗證視蛋白激發或者抑制動作電位效果驗證光照刺激后動作電位記錄結論： 光照可引起神經沖動光激發小鼠從冷凍狀態的恢復光激發小鼠從冷凍狀態的恢復The Microbial Opsin Family of Optogenetic Tools, Cell, 2011視頻一 未導入視蛋白基因小鼠光照后無明顯反應視頻二 導入視蛋白基因小鼠在光線刺激下從冷凍狀態恢復Optogenetics: 10 years of microbial o

11、psinsin neurosciencePhoto courtesy, Guoshen, Stanford光遺傳學光遺傳學l光遺傳學的由來與神經生物學研究l光遺傳學的具體研究l視蛋白l顱外裝置l光遺傳中光學的應用及待解決的問題l光源l光信號檢測Optical neural interfaces, Melissa R. Warden et al, 2014光源的選擇光源的選擇1激光激光激光：laser diode、DPSS（全固態半導體激光器）視蛋白激發：1-5mW/mm2細胞組織反射和散射：100mV優點：定位準確，帶寬窄缺點： 費用較高，$1,000 for 473-nm laser, $5

12、,000-10,000 for 590-nm laser； 激光光源比較脆弱，warm-up time比較長； 體積較大，需專用光學工具實現光纖耦合； 轉接環：方便運動，價格&能量損失多位點光源輸出光源的選擇光源的選擇2LEDLED: PN結中載流子復合，轉化電能為光能LED置于顱外、皮質層，插入腦內，或者與光纖耦合深入腦內 價格經濟（$300），便捷，有多個波段的發光 容易與已有的電生理通道對接缺點： 易造成局部過熱，故不能插入大腦深處； 與光纖耦合能力較弱； 光帶相對比較寬，對于bistable opsin的使用造成困難； 容易造成電流刺激偽跡;神經電生理工具光源的選擇光源的選擇2

13、LEDs ( ultrathin microscale inorganic LEDs)材料：GaN材料，藍光方法：材料擠壓后灌入針頭，由針頭注射進入組織間隙深處，粘合劑溶解，抽出針頭Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014LEDs示意圖IPD: inorganic photon detector;ILED: inorganic LED；光源的選擇光源的選擇2LEDs ( ultrathin microscale inorganic LEDs)優點： 體積50*50*60m，小于光纖(200m)； 減少神經細胞傷害、炎癥； 可與其他材料

14、的條帶一同注射，如熱學材料、電生理感受器;局部過熱問題： 0.3mm深度， 23.5mW/mm2-上升10Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014LEDs示意圖 猴子等動物馴養時間成本、人力成本高，組織切片需要處死動物神經活動的光學信號神經活動的光學信號熒光化學物熒光化學物 Ca2+離子轉錄蛋白指示劑 （GECIs: genetically encoded Ca2+ indicators） 基于綠色熒光蛋白和鈣離子結合域的蛋白，鈣離子濃度變化導致熒光變化（激光激發） 變種完善：發出不同波長的熒光，基于細胞膜電壓變化 小分子熒光染料：電

15、壓或鈣離子濃度 1.fast, sensitive, but not cell-type-specific 2.每次成像前都需要注射，可以持續幾分鐘到幾小時光纖讀取：反映較大范圍內的神經元熒光情況神經活動的光學神經活動的光學讀取讀取光纖光纖 GCaMP3(基于GFP的鈣離子指示蛋白) 激發：單模 檢測：多模，16-channel PMT ； TCSPC(time-correlated single-photon counting)光子數量統計Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014 Ca2+ 染料注射：200-m，0.48-N.A.

16、光纖，PMT收集和檢測光子神經活動的光學讀取神經活動的光學讀取單光子與雙光子單光子與雙光子目標：精準讀取，高時空分辨率單光子和雙光子顯微鏡雙光子和單光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡成像 雙光子激發，非線性光學，熒光強度衰減與1/z2成正比，光強集中雙光子與單光子激發的結果比較雙光子與單光子激發的結果比較John Peter Rickgauer et al, Nat. Neuronsci, 2014Two Photon Excitation Vs Single Photon Excitation單光子與雙光子比較： 單光子深度不超過50-100m； 雙光子能穿透至500m，掃描時間較長，視野小，運動偽

17、跡參數：25g，7.5cm近紅外激光：Ti:Sapphire 激光器能夠于成像200-250m深度神經活動的光學讀取神經活動的光學讀取 雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡微型雙光子顯微鏡用于光遺傳學In awake, freely moving rats, stable imaging was possible except during sudden head movements.A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2

18、001神經活動的光學讀取神經活動的光學讀取 雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡微型雙光子顯微鏡用于光遺傳學一對衍射光柵消除色散A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡信號掃描信號掃描A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neu

19、ro, 2001壓電材料獲得光纖振動；二維不同頻，300-800Hz信號掃描設計李薩如圖形雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡掃描相位矯正掃描相位矯正A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001解決驅動相位與掃描相位不一致發光位置的坐標定位相移補償和定位雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡信號控制系統信號控制系統A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolutio

20、n brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001信號控制系統運動偽跡明顯： 掃描時間長，掃描視野小矯正方法： Heart-beat triggering scanning Licking correction with tunable lens Adaptive image-based movement compensation system雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡缺點和矯正方法缺點和矯正方法微型雙光子顯微鏡用于光遺傳學A miniature head-mounted two-photon microscope, high-resolution brain imaging in freely moving animals, Neuro, 2001Optical neural interfaces, Melissa R. Warden, 2014神經活動的光學讀取神經活動的光學讀取 單單光子顯微鏡光子顯微鏡特點： 儀器聚集在頭部裝置 成像速度快，運動偽跡少 工具量產性能參數： 600-800m視野，2.5m分辨率，每秒36-100幀微型單光子顯微鏡用于光遺傳學目前光遺傳學有待改進的地方目前光遺傳學有待改進的地方Crystal structure of th