1、親和層析法純化胰蛋白酶第一頁，共58頁。 1 內容摘要內容摘要 親和層析包括了一整套復雜的底物及其配體與生物大分子之間相互作用時所形成的獨特的生物學特性。在親和結合的過程中涉及到疏水力、靜電力、范德華力及空間阻力等因素的影響。 親和層析的概念可以理解為配基以共價鍵的形式與水不溶性固體載體共價結合， 形成具有高度專一性的親和吸附劑。以該介質為填料填充親和層析柱，從復雜的混合物中有針對性分離某一種成分。第二頁，共58頁。 本實驗以親和層析方法分離純化豬胰蛋白酶為目的，從豬胰臟提取液中分離純化胰蛋白酶，最終得到純度較高的胰蛋白酶。圍繞親和層析實驗所涉及的蛋白質和酶基本性質及相關技術進行綜合訓練。其中

2、主要包括親和層析介質配基的制備，親和介質的合成，蛋白質和酶的分離純化，酶活性的測定等內容。 通過綜合訓練，能夠系統掌握蛋白質制備的基本原理和操作，學習如何進行實驗設計，掌握實驗過程中的關鍵環節，對實驗中出現的問題進行科學的分析。使學生在學習實驗技術的同時，自覺培養分析問題和解決問題能力。第三頁，共58頁。 2實驗目的方法實驗目的方法 掌握蛋白質分離純化的基本原理與操作技術掌握蛋白質分離純化的基本原理與操作技術 掌握親和層析的基本原理及親和介質合成技術掌握親和層析的基本原理及親和介質合成技術 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定的原理和方法掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測定的原理和方法 掌握消光系數法測定

3、蛋白質的原理及計算方法掌握消光系數法測定蛋白質的原理及計算方法第四頁，共58頁。1. 3實驗流程實驗流程 雞蛋清雞蛋清 Spharose 4B 豬胰臟豬胰臟 提取提取 活化活化 提取提取 分離純化分離純化 純卵粘蛋白純卵粘蛋白(CHOM) 活化活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液胰蛋白酶原粗提液 偶聯偶聯 激活激活 CHOM-Spharose 4B 胰蛋白酶提取液胰蛋白酶提取液 親和層析親和層析 酶促動力學酶促動力學 純胰蛋白酶純胰蛋白酶 酶活性測定酶活性測定 酶蛋白含量測定酶蛋白含量測定第五頁，共58頁。1. 4要求掌握的技術要求掌握的技術 柱層析技術柱層析技術 Sephadex G

4、-25 分子篩層析 DEAE-Cellulose 離子交換層析 CHOM Sepharose 4B 親和層析 蛋白質提取技術蛋白質提取技術 10%TCA 提取雞卵粘蛋白 3.5%乙酸,pH 3.0提取胰蛋白酶原 蛋白含量測定技術蛋白含量測定技術 消光系數法測定胰蛋白酶含量 消光系數法測定雞卵粘蛋白含量第六頁，共58頁。生物活性測定生物活性測定 胰蛋白酶比活性測定 雞卵粘蛋白抑制活性測定 親和介質合成技術親和介質合成技術 載體-Sepharose 4B的前處理 載體 -Sepharose 4B的活化 活化載體-Sepharose 4B的偶聯第七頁，共58頁。第二部分第二部分 實驗方法實驗方法 實

5、驗一實驗一 雞卵粘蛋白的分離純化雞卵粘蛋白的分離純化 1雞卵粘蛋白的基本性質雞卵粘蛋白的基本性質 1.1雞卵粘蛋白的組成 分子量: 28000Da 分子組成: 四個分子量相近的亞基組成糖蛋白 糖基部分: D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸第八頁，共58頁。1.2化學穩定性化學穩定性 耐熱: 在80條件下,理化性質不發生改變 耐有機溶劑: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度 耐沉淀劑: 在10%的TCA的溶液中不發生沉淀. 1.3等電點性質等電點性質 等電點: pI在3.9-4.5之間 溶液中的狀態: 在pH3.0的溶液中穩定, 在pH8.0的溶液中容易分解 雞卵粘蛋白在10%

6、的TCA不同pH值的溶液中的溶解狀態見表1。第九頁，共58頁。表1，雞卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度 溶液pH 值 雞卵粘蛋白 雞卵清蛋白 等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀溶解沉淀溶解高于3.5沉淀溶解沉淀溶解 第十頁，共58頁。1. 2.雞卵粘蛋白的提取雞卵粘蛋白的提取 2.1提?。禾崛。?每組發給50毫升的雞卵清加入一定體積的10% pH1.15 TCA溶液(輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入),攪勻后用pH試紙檢查pH值,待pH穩定在3.5 0.2后放置4冰箱過夜. 2.2離心離心： 轉移50毫升離心杯中,于3000rpm 離心15min。 2.3過濾過濾： 傾出

7、上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質和不溶物 2.4調調pH值值： 用1mol/L HCl 將溶液精確調至pH3.5。量取體積。第十一頁，共58頁。2.5丙酮沉淀丙酮沉淀：緩緩加入三倍體積預冷的丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴，放置冰箱內靜止4小時。 2.6離心離心：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉移到50ml離心杯中，于3000 rpm離心15min。 2.7除殘留丙酮除殘留丙酮：棄去上清液，將盛有沉淀的離心杯至于真空干燥器中。抽去殘留丙酮。（沉淀物的顏色由白變成透明膠狀物即可） 2.8溶解溶解：加入25ml蒸餾水或20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液溶解，濾紙過濾，收集濾液，備用。第十二頁，共58頁

8、。 3雞卵粘蛋白的分離純化雞卵粘蛋白的分離純化 3.1 Sephadex G-25 柱脫鹽柱脫鹽 (1)溶脹溶脹： 稱取15g Sephadex G-25放入500ml的燒杯中, 加入200ml 蒸餾水，在室溫下溶脹24小時或在沸水浴中溶脹2小時。 (2)裝柱裝柱： 取一支303cm 的層析柱，將溶脹好的Sephadex G-25裝柱，自然沉降。 (3) 處理處理： 用2倍柱床體積的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍體積的蒸餾水洗去殘留的NaCl。第十三頁，共58頁。 (4)平衡平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。紫外檢測儀檢測

9、柱內平衡狀態，直到儀器繪出穩定的基線。 (5)上樣上樣： 將柱內的緩沖液液面流至于膠面相切，取20ml雞卵粘蛋白提取液上樣，待樣液液面流至于膠面相切，加入2-3ml緩沖液沖洗層析柱內壁，待溶液液面流至于膠面相切，然后加入緩沖液距膠面高度約2-3cm，以同樣的流速洗脫。 (6)收集收集： 在檢測儀上觀察到開始出現峰時進行收集。見圖1第十四頁，共58頁。 圖1 Sephadex G-25分子篩層析分離圖譜第十五頁，共58頁。3.2 Cellulose離子交換柱層析分離離子交換柱層析分離 (1)溶脹：溶脹： 稱取20g DEAE-Cellulose放入500ml的燒杯中, 加入150ml 蒸餾水，在

10、室溫下溶脹24小時。(2)裝柱：裝柱： 取一支203cm 的層析柱，將溶脹好的DEAE-Cellulose裝柱，自然沉降。 (3) 再生再生： 用200ml 0.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH 混合溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達到pH8.0。用200ml 0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達到pH6.0。第十六頁，共58頁。 (4) 平衡：平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外檢測儀檢測柱內平衡狀態，直到儀器繪出穩定的基線。 (5)上樣：上樣： 將經Sephadex G-25柱脫鹽的卵粘

11、蛋白溶液上樣，用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，直到儀器繪出穩定的基線。流速控制在1.0ml/min左右。 (6)洗脫：洗脫： 用0.3mol/L NaCl - 20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液。 (7)收集：收集： 在檢測儀上觀察到出現高峰時開始收集。見圖2第十七頁，共58頁。圖圖2，雞卵粘蛋白在，雞卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分離柱的分離第十八頁，共58頁。3.3透析及丙酮沉淀透析及丙酮沉淀 (1) 透析：透析： 將經DEAE-Cellulose柱分離的雞卵粘蛋白轉入透析袋內，對蒸餾水透析，隔一段時間換一次水，直到滲出液經BaCl2溶液檢查無氯離子存在，即可

12、。 (2) 調調pH值：值： 將透析好的雞卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精確調至pH4.0（最好一次調成功），量體積。 (3)丙酮沉淀：丙酮沉淀： 加入3倍體積的預冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴，在冰箱內靜止4小時以上或過夜。第十九頁，共58頁。(4)離心：離心： 虹吸出部分上清，將沉淀部分轉移到50ml離心杯中，于3000 rpm離心15min，收集沉淀。 (5) 干燥：干燥： 將盛有雞卵粘蛋白的離心杯放入真空干燥器中干燥。 (6) 收集雞卵粘蛋白成品，冰箱保存。第二十頁，共58頁。4活性測定活性測定 (1)標準胰蛋白酶活性測定 空白: 1.5ml緩沖液1.5ml底物混勻. 樣品:

13、 1.5ml緩沖液1.5ml底物胰蛋白酶10l混勻,立即測定 (2)自提雞卵粘蛋白抑制活性測定 空白: 1.5ml緩沖液1.5ml底物混勻. 樣品: 1.5ml緩沖液雞卵粘蛋白10l胰蛋白酶10l混勻放置2min以上1.5ml底物,立即測定第二十一頁，共58頁。(3) 雞卵粘蛋白含量測定 取透析液0.3ml稀釋10倍, 測定 A280. 3實驗結果實驗結果 (1)計算雞卵粘蛋白收率 (2)計算標準胰蛋白酶的比活性 (3) 計算雞卵粘蛋白的抑制活性。第二十二頁，共58頁。5 試劑配制試劑配制 5.1公用試劑公用試劑 (1) 10%TCA溶液 , pH1.15 , 1500ml (50ml/組)

14、(2) 0.05mol/L ,pH8.0 Tris-HCl緩沖液, (內含0.2% CaCl2) 200ml (3) 2mmol/L BAEE底物溶液 200ml (4) 1mg/L Trypsin標準溶液 10ml 第二十三頁，共58頁。5. 2自配試劑自配試劑 (1) 0.2mol, pH6.6, PBS緩沖液 120ml (10) (2) 0.3mol/L NaCl 0.02mol/L , pH6.6, PBS緩沖液 100ml (3) 0.5mol/L HCl溶液 200ml (4) 0.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH溶液 200ml (5) 0.5mol/L Na

15、Cl 溶液 250ml第二十四頁，共58頁。 6時間安排時間安排 星期星期上午（上午（8：00-12：00）下午（下午（12：00-6：00）晚上晚上一一講實驗，配試劑講實驗，配試劑提 取 雞 卵 粘 蛋 白 ， 裝提 取 雞 卵 粘 蛋 白 ， 裝DEAE和和G25柱，處理各柱，處理各柱柱 二二離心，丙酮沉淀，平衡離心，丙酮沉淀，平衡G25柱和柱和DEAE柱，離心，柱，離心，去丙酮去丙酮上上G25柱脫鹽，收集第一柱脫鹽，收集第一峰，上峰，上DEAE柱分離，收柱分離，收集第二峰，對蒸餾水透析集第二峰，對蒸餾水透析過夜。過夜。 三三換水，取樣測粘蛋白抑換水，取樣測粘蛋白抑制活性和標準胰蛋白酶制活

16、性和標準胰蛋白酶活性，透析液調活性，透析液調pH4，丙酮沉淀。丙酮沉淀。繼續測定標準酶活性和抑繼續測定標準酶活性和抑制活性，離心，收集沉淀制活性，離心，收集沉淀物物4干燥。干燥。結束實驗結束實驗 第二十五頁，共58頁。實驗二實驗二 親和層析純化胰蛋白酶親和層析純化胰蛋白酶第二十六頁，共58頁。1 原理原理 雞卵粘蛋白(ovomucoid, 簡稱CHOM)，是胰蛋白酶的天然抑制劑，在pH7.8- 8.0的緩沖溶液中二者發生專一性的親和作用。以雞卵粘蛋白為配基，偶聯在已經活化的瓊脂糖凝膠層析介質-Sepharose 4B上，制備成雞卵粘蛋白親和層析介質（CHOM- Sepharose 4B）。然后

17、通過親和層析法從胰蛋白酶粗提液中分離純化胰蛋白酶。常用的載體活化與蛋配基偶聯的方法有環氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反應的基本原理如下圖所示：第二十七頁，共58頁。1.1環氧氯丙烷活化載體與蛋白質配基的偶聯 活化 第二十八頁，共58頁。偶聯 親和結合 第二十九頁，共58頁。洗脫洗脫 第三十頁，共58頁。1.2溴化氰活化載體 與蛋白質配基的偶聯 第三十一頁，共58頁。2親和介質合成親和介質合成2.1瓊脂糖凝膠層析介質(Sepharose 4B)的活化2.1.1 瓊脂糖凝膠層析介質的處理瓊脂糖凝膠層析介質的處理稱取10克瓊脂糖凝膠層析介質，置于G-3玻璃燒結漏斗內，用100ml 1.0mol/L N

18、aCl溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸餾水抽洗，抽干后轉移到100ml三角瓶中備用。 第三十二頁，共58頁。2.1.2配方配方 瓊脂糖凝膠層析介質-QT410克 蒸餾水7ml 1,4二氧六環8 ml 2 mol/L NaOH 6.5ml 環氧氯丙烷1.5ml。 第三十三頁，共58頁。2.1.3活化活化 將配制的好介質的三角瓶，放入45恒溫水浴中，于160轉/分鐘，振搖活化2小時。停止活化，轉移到G-3玻璃燒結漏斗內，抽去活化劑，用100ml蒸餾水洗（少量多次），轉移100ml到三角瓶中，準備偶聯。 第三十四頁，共58頁。2.2偶聯偶聯 稱取約100mg雞卵粘蛋白，用10ml 0.1mol/

19、L pH9.5 Na2CO3緩沖液充分溶解。取0.1ml稀釋10倍測定OD280，計算溶液的蛋白濃度。然后將溶解好的雞卵粘蛋白溶液，轉移到100ml三角瓶中與活化的瓊脂糖凝膠介質混勻。在40恒溫水浴中，于160轉/分鐘，振搖偶聯22小時左右，停止偶聯。 第三十五頁，共58頁。2.3洗滌洗滌 取一個洗凈的500ml抽濾瓶，將已經偶聯好的瓊脂糖凝膠層析介質轉移到G-3玻璃燒結漏斗內抽濾，收集濾液，測定濾液中剩余的雞卵粘蛋白的含量。 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml 蒸餾水抽洗，再用20ml 親和層析洗脫液洗滌。 將親和介質轉移到50ml的小燒杯內，加入20ml 親和層析

20、平衡液，浸泡20分鐘，脫氣，裝柱。 第三十六頁，共58頁。3胰蛋白酶粗提液的制備胰蛋白酶粗提液的制備3.1胰蛋白酶的基本性質3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于動物的胰臟或其他組織中。在底物的誘導下或激活劑的作用下，酶原的C端水解，去6肽轉變成具有活性的胰蛋白酶。 - 6 肽 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 Ca+2 激活劑第三十七頁，共58頁。3.1.2等電點與分子量：等電點與分子量：胰蛋白酶原的 pI=10.8 ， 分子量：24000Da胰蛋白酶的 pI=8.9 ， 分子量：23700Da 第三十八頁，共58頁。3.1.3 穩定性穩定性 胰蛋白酶在酸性環境中很穩定，在堿性環境中容易

21、自溶，在提取的過程中要注意溶液的pH值。 當溶液的 pH 2.0 容易變性 pH = 3.0 生物活性穩定 pH 7.0 容易自溶第三十九頁，共58頁。3.2胰蛋白酶原的提取胰蛋白酶原的提取(1)勻槳: 取約30克豬胰臟，剝去結締組織和脂肪，取凈重20-25克左右,剪成碎塊。轉移到組織搗碎器內,加入150ml 預冷的3.5%的乙酸酸化水,勻槳.(2)提取: 轉移到500ml燒杯中,用2mol/L硫酸調節pH值在3.5-4.0之間,10攪拌提取約4小時.(3)過濾: 取一塊紗布,折疊成四層,用水潤濕,放在玻璃漏斗上,將胰蛋白酶原提取液過濾,收集濾液.第四十頁，共58頁。(4)酸化: 用2mol/

22、L硫酸調節濾液的pH值至2.5-3.0之間,4冰箱靜止沉淀4小時以上。(5)過濾: 折疊濾紙過濾,收濾液。 第四十一頁，共58頁。3.3胰蛋白酶原的激活胰蛋白酶原的激活(1)調節pH值: 用5mol/L NaOH 將濾液精確調節pH值至pH8.0,量取溶液體積.(2)加激活劑: 加入固體CaCl2使溶液的Ca+2 終濃度達到0.1mol/L,然后加入約5mg 結晶胰蛋白酶,混勻,激活.(3)激活時間: 在4冰箱內激活12-16小時, 在25恒溫水浴中激活2-4小時.第四十二頁，共58頁。3.4停止激活停止激活(1)活性測定:取1ml上清液分別測定蛋白濃度和活性.具體操作見活性測定部分.(2)停

23、止激活:等酶溶液的比活性達到1000u/mg左右, 用2mol/L硫酸調節pH值到3.0.(3)過濾: 濾紙過濾,濾去CaSO4沉淀,收集濾液, 4冰箱保存. 第四十三頁，共58頁。4親和層析分離胰蛋白酶親和層析分離胰蛋白酶(1)裝柱:取一支層析柱(101.0cm),將合成好的親和層析介質CHOM-Sepharose 4B 裝入柱內,自然沉降. (2)平衡:以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡.(3)上樣:將以經激活的胰蛋白酶提取液, 用5mol/L NaOH 精確調節pH值至pH8.0, 濾紙過濾,取濾液

24、上樣.通過親和介質的偶聯量和胰蛋白酶粗提液的比活性,計算出上樣所需體積.計算方法如下: 第四十四頁，共58頁。 偶聯mg數0.861.3104(u/mg)上樣體積(ml)= 粗酶濃度(mg/ml)比活(u/mg)第四十五頁，共58頁。(4)平衡平衡: 上完樣以后, 以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡,洗去未被吸附的雜蛋白。(5)(5)洗脫洗脫: : 等平衡到基線穩定后,用0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脫.收集洗脫峰。第四十六頁，共58頁。(6)(6)親和層析洗脫曲線親和層

25、析洗脫曲線: :第四十七頁，共58頁。 胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶活性測定1胰蛋白酶活性測定胰蛋白酶活性測定1.1胰蛋白酶測定的基本原理胰蛋白酶測定的基本原理 胰蛋白酶是一種蛋白水解酶,它除了能水解堿性氨基酸與其它氨基酸形成的肽鍵外,還能水解堿性氨基酸所形成的酯鍵,催化活性具有高度的專一性.因此,可以用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N- benzoyl-L-argine ethyl ester,簡稱BAEE)為底物測定胰蛋白酶活性. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在堿性條件下,經胰蛋白酶作用水解去一個乙基生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA), 催化反應原理如圖所示。 第四十八頁，共

26、58頁。由于BAEE在波長253nm處的光吸收值遠遠弱于BA。因此，可以在加入酶為零點,測定在X分鐘內的遞增吸光值.通過酶的定義求出酶活性。 第四十九頁，共58頁。1.2測定胰蛋白酶活性的定義測定胰蛋白酶活性的定義底物濃度 C =1mmol/L光程:L=1cm波長: =253nm 1個BAEE單位溫度: T=25體積: V=3ml遞增值: O.D =0.001A 第五十頁，共58頁。1.3計算公式(1)活性單位 O.DBAEE單位(u/ml) = N(稀釋倍數) 0.001 (2)比活性 測得的BAEE 活性單位(u/ml)BAEE單位(u/mg) = 胰蛋白酶濃度mg/ml)加入體積(ml)

27、 第五十一頁，共58頁。2雞卵粘蛋白活性的測定雞卵粘蛋白活性的測定 雞卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制劑,通常1g雞卵粘蛋白能抑制0.86g胰蛋白酶的活性(相當于1 : 0.86).在胰蛋白酶液中加入適量的雞卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就會降低,胰蛋白酶遞減的活性就是雞卵粘蛋白的抑制活性.在同樣的條件下分別測定出未加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A1和加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A2. 將A1 - A2就可以得到雞卵粘蛋白的抑制活性.計算公式如下: 第五十二頁，共58頁。(1)抑制活性抑制活性 A1 A2BAEE單位(Iu/ml) = N(稀釋倍數) 0.001A1 ：胰蛋白酶活性A2：加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性(2)抑制比活 測得的BAEE 活性單位(Iu/ml)BAEE單位( Iu/mg) = 雞卵粘蛋白濃度(mg/ml)加入體積(ml) 第五十三頁，共58頁。3蛋白質含量測定蛋白質含量測定3.1消光系數的定義：在蛋白質分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在280nm處有最大吸收峰。蛋白質分子中含有芳香族氨基酸的數量以及分子的緊密程度有差異，在280nm處的光吸收強弱不同。