1、實(shí)驗(yàn)五、培養(yǎng)基的制備和消毒滅菌實(shí)驗(yàn)五、培養(yǎng)基的制備和消毒滅菌一、培養(yǎng)基的制備：一、培養(yǎng)基的制備：（一）目的要求：（一）目的要求：學(xué)習(xí)掌握配置培養(yǎng)基的一般方法、步驟和原理。學(xué)習(xí)掌握配置培養(yǎng)基的一般方法、步驟和原理。（二）原理：（二）原理： 培養(yǎng)基培養(yǎng)基是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝是按照微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而產(chǎn)物所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的一種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、成的一種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽和水等營(yíng)養(yǎng)要素。無(wú)機(jī)鹽和水等營(yíng)養(yǎng)要素。 由于不同微生物細(xì)胞組成不同，因而所需由于不同微生物細(xì)胞組成不同，因而所需營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)

2、不同，為了分離、培養(yǎng)和鑒定不同的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不同，為了分離、培養(yǎng)和鑒定不同的微生物，必須根據(jù)其需要，配制合適的培養(yǎng)基。微生物，必須根據(jù)其需要，配制合適的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的制備原則：培養(yǎng)基的制備原則：1.根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基。根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配置不同的培養(yǎng)基。2.調(diào)配好培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和比例。調(diào)配好培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和比例。3.控制微生物的培養(yǎng)條件（滲透壓、控制微生物的培養(yǎng)條件（滲透壓、pH、氧化還原、氧化還原電位等）電位等）細(xì)菌細(xì)菌 牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨放線菌放線菌 高氏高氏1號(hào)號(hào)真菌真菌 查氏、馬丁氏查氏、馬丁氏各類各類M 土豆葡萄糖土豆葡萄糖（三）器材：（三

3、）器材：1.藥品和試劑：藥品和試劑：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、瓊脂、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉、瓊脂、NaCl、K2HPO4、 KH2PO4、 KNO3、MgSO4、 FeSO4、孟加拉紅、孟加拉紅、1mol/L NaOH、2.器材：器材：試管、燒杯、三角瓶、量筒、玻璃棒、鐵架臺(tái)、漏試管、燒杯、三角瓶、量筒、玻璃棒、鐵架臺(tái)、漏斗、天平、牛角匙、高壓鍋、微波爐、斗、天平、牛角匙、高壓鍋、微波爐、 pH試紙?jiān)嚰垼?.5-9.0）、棉花、紗布、線繩、聚丙烯袋等。）、棉花、紗布、線繩、聚丙烯袋等。（四）步驟：（四）步驟：斜面培養(yǎng)基制作斜面培養(yǎng)基制作：計(jì)算計(jì)算 稱量稱量 加熱溶化加熱溶

4、化 調(diào)調(diào)PH 過(guò)濾（可省略）過(guò)濾（可省略） 分裝分裝 加塞（附棉塞加塞（附棉塞制作）制作） 包扎包扎 滅菌滅菌 擺斜面擺斜面 無(wú)菌檢查無(wú)菌檢查 1. 1.稱量稱量 按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于燒杯中。對(duì)于不是粉狀藥品（如牛肉于燒杯中。對(duì)于不是粉狀藥品（如牛肉膏），應(yīng)用燒杯和玻璃棒稱量。膏），應(yīng)用燒杯和玻璃棒稱量。2.2.配制配制 向燒杯中加入適量的水，攪拌，使其溶向燒杯中加入適量的水，攪拌，使其溶解（可加熱助溶）。解（可加熱助溶）。 如果配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂熔化時(shí)，如果配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂熔化時(shí)，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢需不斷攪拌，并控制火

5、力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。一般要求瓊脂沸騰出或燒焦。一般要求瓊脂沸騰3 3次，完全熔次，完全熔化后，補(bǔ)足所失水分。化后，補(bǔ)足所失水分。 3. 3.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值值 培養(yǎng)基溶解用培養(yǎng)基溶解用pHpH試紙測(cè)試紙測(cè)pHpH，然后根據(jù)要求，然后根據(jù)要求加酸或堿（一般用加酸或堿（一般用1M HCl1M HCl和和1M NaOH1M NaOH），要緩），要緩慢少量且多加攪拌。培養(yǎng)基配方為自然慢少量且多加攪拌。培養(yǎng)基配方為自然pHpH時(shí)，時(shí)，不用調(diào)節(jié)。不用調(diào)節(jié)。 4.4.過(guò)濾過(guò)濾 用濾紙或多層紗布過(guò)濾，一般無(wú)特殊要用濾紙或多層紗布過(guò)濾，一般無(wú)特殊要求可省去。求可省去。 5. 5.分裝分裝 將制好的培養(yǎng)基

6、分裝入試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)，將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。固體培養(yǎng)基要趁熱裝。管（瓶）口塞上棉塞。固體培養(yǎng)基要趁熱裝。 分裝時(shí)要避免培養(yǎng)基粘染管（瓶）口，引起污分裝時(shí)要避免培養(yǎng)基粘染管（瓶）口，引起污染。分裝量可分為下面幾方面：染。分裝量可分為下面幾方面：（1 1）斜面：裝量為管長(zhǎng)的）斜面：裝量為管長(zhǎng)的1/51/5。（2 2）液體培養(yǎng)基：裝量為管長(zhǎng)的）液體培養(yǎng)基：裝量為管長(zhǎng)的1/41/4。 （3 3）半固體培養(yǎng)基：裝載量為管長(zhǎng)的）半固體培養(yǎng)基：裝載量為管長(zhǎng)的1/31/3。6.6.滅菌滅菌 塞棉塞，包扎，滅菌。培養(yǎng)基做完后，要求塞棉塞，包扎，滅菌。培養(yǎng)基做完后，要求在在2

7、-42-4小時(shí)內(nèi)滅菌，否則會(huì)被污染。小時(shí)內(nèi)滅菌，否則會(huì)被污染。7.7.擺斜面擺斜面 滅菌完畢，冷卻到滅菌完畢，冷卻到6060左右再擺斜面，以免左右再擺斜面，以免產(chǎn)生過(guò)多冷凝水。產(chǎn)生過(guò)多冷凝水。棉塞制作棉塞制作 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（ g/L,培養(yǎng)細(xì)菌用）牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g瓊脂 15-20g（取18g）水 1000mlpH 7.0-7.2121滅菌20min 高氏1號(hào)（ g/L,培養(yǎng)放線菌用）可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g瓊脂 15-20g（取18g）水 1000mlpH 7.2-7.4121

8、滅菌20min 馬丁氏培養(yǎng)基（g/L,分離真菌用）葡萄糖 10g蛋白胨 5gKH2PO4 1gMgSO4 0.5g1/3000 孟加拉紅 100ml瓊脂 15-20g （取18g）pH 自然水 補(bǔ)足至1000ml115滅菌30min（五）注意事項(xiàng)：（五）注意事項(xiàng)：1.1.稱量要準(zhǔn)確，取藥品的角匙不能混用。稱量要準(zhǔn)確，取藥品的角匙不能混用。2.2.加熱融化時(shí)要不斷攪拌，以免糊底和溢出加熱融化時(shí)要不斷攪拌，以免糊底和溢出, ,（每加熱（每加熱30s30s關(guān)掉電源，開蓋看一次）。關(guān)掉電源，開蓋看一次）。3.3.蛋白胨極易吸濕，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。蛋白胨極易吸濕，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。4.4.淀粉要先用少量

9、冷水調(diào)成糊狀，倒入沸水淀粉要先用少量冷水調(diào)成糊狀，倒入沸水中，加熱溶解，再加入其它成分，以免成干中，加熱溶解，再加入其它成分，以免成干面團(tuán)。面團(tuán)。5.5.對(duì)微量成分，先配成溶液后再加入。對(duì)微量成分，先配成溶液后再加入。6.6.節(jié)約藥品。節(jié)約藥品。二、消毒滅菌：二、消毒滅菌：物理法：加熱、過(guò)濾、照射物理法：加熱、過(guò)濾、照射化學(xué)法：化學(xué)藥品化學(xué)法：化學(xué)藥品灼燒灼燒干熱干熱濕熱濕熱加熱加熱高壓高壓間歇間歇煮沸煮沸（一）目的要求：（一）目的要求：1.了解干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和紫外線滅菌的了解干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和紫外線滅菌的原理及應(yīng)用范圍。原理及應(yīng)用范圍。2.掌握干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和紫外線滅菌

10、的掌握干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和紫外線滅菌的技術(shù)。技術(shù)。（二）原理：（二）原理：加熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)加熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性達(dá)到滅菌的目的。變性達(dá)到滅菌的目的。干熱：干熱：160-170 1.5-2h濕熱：濕熱：121.3 15-30min紫外線滅菌是誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體的形成，而紫外線滅菌是誘導(dǎo)胸腺嘧啶二聚體的形成，而抑制了抑制了DNA的復(fù)制。另外，電離過(guò)程中生成的的復(fù)制。另外，電離過(guò)程中生成的O3和和H2O2均有殺菌作用。均有殺菌作用。適用范圍適用范圍濕熱主要用于各類培養(yǎng)基及液體物質(zhì)濕熱主要用于各類培養(yǎng)基及液體物質(zhì)干熱主要用于玻璃、金屬等器皿、工具干熱主

11、要用于玻璃、金屬等器皿、工具紫外線主要用于接種箱、無(wú)菌室內(nèi)空氣紫外線主要用于接種箱、無(wú)菌室內(nèi)空氣及物體表面滅菌及物體表面滅菌（三）器材：（三）器材：各種培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、移液管、高壓蒸汽滅菌鍋、各種培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、移液管、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱、紫外線燈等。電熱鼓風(fēng)干燥箱、紫外線燈等。（四）操作步驟：（四）操作步驟：1.濕熱滅菌（高壓蒸汽）濕熱滅菌（高壓蒸汽）向鍋內(nèi)加入適量的水向鍋內(nèi)加入適量的水 裝待滅菌物品裝待滅菌物品 加蓋加蓋 加熱加熱 排冷空氣排冷空氣 升壓、升溫升壓、升溫 維持所需維持所需溫度溫度20-30min 降壓、降溫降壓、降溫 開蓋取物開蓋取物 趁熱擺斜面趁熱擺斜面 2.干熱滅菌（干燥箱）干熱滅菌（干燥箱）將待滅菌物品包好將待滅菌物品包好 裝入待滅菌物品裝入待滅菌物品 升溫升溫 恒溫恒溫 降溫（降溫（70以下）以下） 開箱取物開箱取物 3.紫外線滅菌（接種箱或無(wú)菌室內(nèi)）紫外線滅菌（接種箱或無(wú)菌室內(nèi)）放入待滅菌物品放入待滅菌物品 甲醛（酒精）熏蒸甲醛（酒精）熏蒸 開紫外線燈（開紫外線燈（30min） 關(guān)燈關(guān)燈 工作工作（五）注意事項(xiàng)：（五）注意事項(xiàng)：1.高壓滅菌：切勿脫水工作，排凈冷空氣，工作高壓滅菌：切勿脫水工作，排凈冷空氣，工作人員不能遠(yuǎn)離，當(dāng)壓力降到人員不能遠(yuǎn)離，當(dāng)壓力降到“0”時(shí)再開蓋取物。時(shí)再開蓋