1、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院第五章第五章 診斷酶學(xué)診斷酶學(xué) 退出退出 衛(wèi)生部衛(wèi)生部“十一五十一五” 規(guī)劃教材規(guī)劃教材 全國高等醫(yī)藥教材建設(shè)研究會規(guī)劃教材全國高等醫(yī)藥教材建設(shè)研究會規(guī)劃教材檢驗科檢驗科 敬明輝敬明輝 主要內(nèi)容 六、六、 同工酶和亞型的測定同工酶和亞型的測定 一、酶的一般特征一、酶的一般特征 二、血清酶二、血清酶 三、酶促反應(yīng)動力學(xué)三、酶促反應(yīng)動力學(xué) 四、酶活性濃度測定技術(shù)四、酶活性濃度測定技術(shù) 五、五、 酶的免疫化學(xué)測定酶的免疫化學(xué)測定 七、工具酶及其臨床應(yīng)用七、工具酶及其臨床應(yīng)用 八、臨床常用血清酶及其同工酶八、臨床常用血清酶及其同工酶 第一節(jié)第一節(jié) 酶的一般特征酶

2、的一般特征 返回章返回章 1. 1. 酶、核酶。酶、核酶。2. 2. 酶的催化特性酶的催化特性：極高的催化效率、高度的特異性、：極高的催化效率、高度的特異性、催化作用的可調(diào)節(jié)性。催化作用的可調(diào)節(jié)性。3. 3. 酶促反應(yīng)：酶促反應(yīng)：酶所催化的反應(yīng)。酶所催化的反應(yīng)。 酶活性：酶活性：酶催化反應(yīng)的能力。酶催化反應(yīng)的能力。 底物底物(S)(S)：酶所作用的物質(zhì)。酶所作用的物質(zhì)。 產(chǎn)物產(chǎn)物(P)(P)：酶促反應(yīng)的生成物。酶促反應(yīng)的生成物。 酶的激活劑酶的激活劑: : 加速酶促反應(yīng)的物質(zhì)。加速酶促反應(yīng)的物質(zhì)。 酶的抑制劑酶的抑制劑: : 減慢或終止酶促反應(yīng)的物質(zhì)。減慢或終止酶促反應(yīng)的物質(zhì)。一、基本概念一、

3、基本概念 返回節(jié)返回節(jié) 二、酶的結(jié)構(gòu)與催化作用二、酶的結(jié)構(gòu)與催化作用 單純酶和結(jié)合酶單純酶和結(jié)合酶 單純酶：單純酶：只含多肽鏈，是單純蛋白質(zhì)。只含多肽鏈，是單純蛋白質(zhì)。 結(jié)合酶：結(jié)合酶：由酶蛋白和輔因子組成。由酶蛋白和輔因子組成。 兩者結(jié)合后形成的復(fù)合物稱為全酶。兩者結(jié)合后形成的復(fù)合物稱為全酶。 與酶蛋白結(jié)合疏松的稱為輔酶。與酶蛋白結(jié)合疏松的稱為輔酶。 與酶蛋白結(jié)合牢固的稱為輔基。與酶蛋白結(jié)合牢固的稱為輔基。 酶的活性中心酶的活性中心 酶與底物結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物發(fā)生在酶表面的酶與底物結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物發(fā)生在酶表面的一個特定區(qū)域。一個特定區(qū)域。 酶的催化作用機制酶的催化作用機制 誘導(dǎo)契合

4、學(xué)說。誘導(dǎo)契合學(xué)說。 返回節(jié)返回節(jié) 三、酶的命名、分類及編號三、酶的命名、分類及編號 返回節(jié)返回節(jié) 臨床應(yīng)用酶臨床應(yīng)用酶ECEC編號編號習(xí)慣用名習(xí)慣用名英語縮寫英語縮寫ECEC編號編號習(xí)慣用名習(xí)慣用名英語縮寫英語縮寫1.1.1.271.1.1.27乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶LDLD、LDHLDH2.7.3.22.7.3.2肌酸激酶肌酸激酶CKCK、CPKCPK1.1.1.371.1.1.37蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶MDMD、MDHMDH3.1.1.33.1.1.3脂肪酶脂肪酶LPSLPS1.1.1.411.1.1.41異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶ICDICD、ICDHICDH3.1.1.83.1.1

5、.8膽堿酯酶膽堿酯酶CHECHE1.1.1.491.1.1.496-6-磷酸葡萄糖脫氫酶磷酸葡萄糖脫氫酶G6PDHG6PDH3.1.3.13.1.3.1堿性磷酸酶堿性磷酸酶ALPALP、AKPAKP1.4.1.31.4.1.3谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶GLDGLD、GLDHGLDH3.1.3.23.1.3.2酸性磷酸酶酸性磷酸酶ACPACP1.4.3.41.4.3.4單氨氧化酶單氨氧化酶MODMOD3.1.3.53.1.3.55-5-核苷酸酶核苷酸酶5-NT5-NT2.1.3.32.1.3.3鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶OCTOCT3.2.1.13.2.1.1-淀粉酶淀粉酶AMYAM

6、Y、AMSAMS2.3.2.22.3.2.2-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶-GT-GT、GGTGGT3.2.1.303.2.1.30-N-N-乙酰乙酰( (基基)-)-D D氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶NAGNAG2.4.1.12.4.1.1糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶GPGP3.2.1.513.2.1.51-L-L-巖藻糖苷酶巖藻糖苷酶-FU-FU、AFUAFU2.5.1.182.5.1.18谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GSTGST3.4.23.13.4.23.1亮氨酸氨基肽酶亮氨酸氨基肽酶LAPLAP2.6.1.12.6.1.1門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ASTAST、GOTGOT4.

7、1.2.134.1.2.13果糖二磷酸醛縮酶果糖二磷酸醛縮酶ALDALD2.6.1.22.6.1.2丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALTALT、GPTGPT1.類別 1，亞類 1，亞-亞類 27，編號順序 第二節(jié)第二節(jié) 血清酶血清酶 返回章返回章 血漿特異酶血漿特異酶 為血漿蛋白的固有成分，在血漿中發(fā)揮特定的為血漿蛋白的固有成分，在血漿中發(fā)揮特定的催化作用。多數(shù)由肝臟合成并以酶原形式分泌入，催化作用。多數(shù)由肝臟合成并以酶原形式分泌入，在一定條件下被激活起作用。與凝血有關(guān)的酶或酶在一定條件下被激活起作用。與凝血有關(guān)的酶或酶原、原、ChEChE、CpCp及及LPLLPL等。等。非血漿特異酶非血漿

8、特異酶 外分泌酶：外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌進(jìn)入血漿的由外分泌腺合成并分泌進(jìn)入血漿的酶酶, ,包括包括P-AMYP-AMY、P-LPSP-LPS、前列腺、前列腺ACPACP等。等。 細(xì)胞內(nèi)酶：細(xì)胞內(nèi)酶：存在于細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝的酶，存在于細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝的酶，隨著細(xì)胞的不斷更新或破壞可少量釋入血液。當(dāng)其隨著細(xì)胞的不斷更新或破壞可少量釋入血液。當(dāng)其大量出現(xiàn)于血清中時，提示酶的來源組織細(xì)胞受大量出現(xiàn)于血清中時，提示酶的來源組織細(xì)胞受損，最常用于臨床診斷。損，最常用于臨床診斷。ASTAST一、血清酶的來源一、血清酶的來源 返回節(jié)返回節(jié) 二、血清酶的去路二、血清酶的去路 血清酶的半壽期血清酶的半

9、壽期 (T1/2) (T1/2) 定義：定義： 酶失活至原來一半時所需時間。酶失活至原來一半時所需時間。 半壽期半壽期代表酶從血中清除的快慢。半壽期長的酶，代表酶從血中清除的快慢。半壽期長的酶，在血清中持續(xù)時間長。在血清中持續(xù)時間長。 ALT ALT大于大于ASTAST 血清酶的失活和排泄血清酶的失活和排泄 酶的清除酶的清除主要是在血管內(nèi)失活或分解。主要是在血管內(nèi)失活或分解。 血清酶血清酶經(jīng)蛋白酶水解產(chǎn)物（多肽或氨基酸）經(jīng)蛋白酶水解產(chǎn)物（多肽或氨基酸） 可經(jīng)小腸粘膜排至腸腔，再徹底分解成氨基可經(jīng)小腸粘膜排至腸腔，再徹底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分可被組織利用，不能酸后被重吸收，其中大部分

10、可被組織利用，不能利用的氨基酸則隨尿排出體外。利用的氨基酸則隨尿排出體外。 返回節(jié)返回節(jié) 三、血清酶的生理變異三、血清酶的生理變異 1 1.性別性別 少數(shù)酶如CK、ALP及GGT等有性別差異，與血清酶的 來源組織有關(guān); 女性雌激素原因LD升高, 男性肌肉發(fā) 達(dá)CK升高 。2.年齡 血清酶的活性隨年齡而變化，ALP和GGT到老年時可有 輕度升高。年齡差異也見于同工酶; ALP在骨骼中與成 骨細(xì)胞有關(guān)兒童升高 。3.進(jìn)食 過量飲酒可使血清GGT明顯升高。4.運動 多種血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度與運動量、持續(xù)時間、運動頻率及 骨骼肌所含的酶量有關(guān)。5.妊娠

11、 胎盤組織可分泌一些酶進(jìn)入母體血液，如耐熱ALP、 LD、LAP和ALT（少數(shù)）等，引起血清中這些酶活性升 高,妊娠由于血容量升高血液稀釋血漿蛋白下降腸道吸 收脂肪能力增加APOB,APOA,TG,TC升高妊娠中后期由于 雌激素G升高分娩時由于肌肉強烈收縮CK升高 。6.其他 一些酶活性與體重、身高的增長、體位改變、晝夜變 化及家庭因素有關(guān)。 返回節(jié)返回節(jié) 酶合成異常酶合成異常u合成減少合成減少 慢肝凝血酶減少慢肝凝血酶減少PTPT延長延長 銅氧化酶減少銅氧化酶減少u合成增多合成增多 增殖性疾病增殖性疾病 骨骼疾病骨骼疾病ALP ALP 前列腺癌前列腺癌ACP ACP 酶釋放增加酶釋放增加:

12、: 大多數(shù)血清酶增高的主要原因大多數(shù)血清酶增高的主要原因u細(xì)胞內(nèi)外酶濃度差異細(xì)胞內(nèi)外酶濃度差異 LD LD 紅細(xì)胞比血清紅細(xì)胞比血清100100倍倍u酶蛋白分子量的大小酶蛋白分子量的大小 LDCKLDCK當(dāng)心梗當(dāng)心梗CKCK升高早于升高早于LDLDu酶的組織分布酶的組織分布 AST,ALT,CKAST,ALT,CK分別以心肝骨最豐富分別以心肝骨最豐富 u酶在細(xì)胞內(nèi)定位和存在形式酶在細(xì)胞內(nèi)定位和存在形式 在細(xì)胞容易釋放入血在在細(xì)胞容易釋放入血在 線粒體線粒體ASTAST難釋放等到細(xì)胞出現(xiàn)壞死病變才能釋放入血難釋放等到細(xì)胞出現(xiàn)壞死病變才能釋放入血 GGT GGT存在肝毛細(xì)膽管上皮細(xì)胞，肝膽疾病就上

13、升存在肝毛細(xì)膽管上皮細(xì)胞，肝膽疾病就上升 酶的清除異常酶的清除異常 不同疾病和不同的酶從血中清除時間和機制不同。不同疾病和不同的酶從血中清除時間和機制不同。 如如AMYAMY和和ALPALP經(jīng)腎臟或膽道排出異常而致血清酶升高。經(jīng)腎臟或膽道排出異常而致血清酶升高。 返回節(jié)返回節(jié) 第三節(jié)第三節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué)酶促反應(yīng)動力學(xué) 返回章返回章 Michaelis Michaelis 和和MentenMenten提出的酶作用的中間產(chǎn)物學(xué)說提出的酶作用的中間產(chǎn)物學(xué)說: : maxSKmSVV一、米曼氏方程一、米曼氏方程 E+SK1K2K3 返回節(jié)返回節(jié) 19131913年提出了著名的酶促反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)

14、系的年提出了著名的酶促反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的 方程式，即米方程式，即米- -曼氏方程曼氏方程(Michaelis-Menten (Michaelis-Menten equation):equation):E+PES二、二、KmKm與與Vmax Vmax KmKm值：值：等于酶促反應(yīng)的初速率為最大速率等于酶促反應(yīng)的初速率為最大速率VmaxVmax一半一半 時的底物濃度，即時的底物濃度，即V VVmaxVmax時，則時，則KmKmSS。KmKm 在臨床上的應(yīng)用：在臨床上的應(yīng)用： 反映酶與底物的親合力，且與親合力成反比。反映酶與底物的親合力，且與親合力成反比。 用來計算不同底物濃度時酶促反應(yīng)速度相

15、當(dāng)于最用來計算不同底物濃度時酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最 大反應(yīng)速度的百分率。大反應(yīng)速度的百分率。 根據(jù)根據(jù)KmKm值選擇酶的最適底物值選擇酶的最適底物, ,幾種低物幾種低物KMKM最小此酶最最小此酶最 適底物適底物 確定工具酶用量。確定工具酶用量。 確定代謝酶系中的限速反應(yīng)和作為鑒別酶的依據(jù)確定代謝酶系中的限速反應(yīng)和作為鑒別酶的依據(jù), ,尋尋 找代謝的限速步驟找代謝的限速步驟KMKM最大的酶所催化的反應(yīng)最大的酶所催化的反應(yīng) VmaxVmax：酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，代表了在一酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，代表了在一 定酶量下的最大反應(yīng)速率定酶量下的最大反應(yīng)速率。 返回節(jié)返回節(jié) 三、酶促反應(yīng)進(jìn)程

16、曲線三、酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線 如將酶反應(yīng)過程中測得的產(chǎn)物如將酶反應(yīng)過程中測得的產(chǎn)物PP或底物或底物SS變化量對時間作圖，可得酶促反變化量對時間作圖，可得酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線。圖中產(chǎn)物應(yīng)時間進(jìn)程曲線。圖中產(chǎn)物PP或底物或底物SS變化曲線的斜率就代表酶促反應(yīng)的速率。變化曲線的斜率就代表酶促反應(yīng)的速率。延滯期延滯期線性反應(yīng)期線性反應(yīng)期底物耗盡期底物耗盡期必須根據(jù)線性反應(yīng)期必須根據(jù)線性反應(yīng)期的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計算的反應(yīng)速率才能準(zhǔn)確計算出酶活性濃度。出酶活性濃度。 返回節(jié)返回節(jié) 四、影響酶促反應(yīng)的因素四、影響酶促反應(yīng)的因素 底物濃度對酶促反應(yīng)的影響底物濃度對酶促反應(yīng)的影響（1 1）當(dāng)）當(dāng)SKmSKm SKm

17、時時，反應(yīng)速率，反應(yīng)速率與底物濃度與底物濃度SS無關(guān)，無關(guān)， V VVmaxVmaxK EK E 稱為稱為零級反應(yīng)零級反應(yīng)，反應(yīng)速率反應(yīng)速率與酶濃度與酶濃度EE成正比成正比。酶學(xué)測。酶學(xué)測定時一般底物濃度可選擇為定時一般底物濃度可選擇為KmKm的的10102020倍。倍。 返回節(jié)返回節(jié) 四、影響酶促反應(yīng)的因素四、影響酶促反應(yīng)的因素 1.1.酶濃度過高過早或過多消耗底物酶濃度過高過早或過多消耗底物肝炎肝炎ALTALT升高需生理鹽水稀釋升高需生理鹽水稀釋2.2.底物底物 KM KM值小，足夠溶解度，特值小，足夠溶解度，特異性高，穩(wěn)定性好異性高，穩(wěn)定性好3.pH 3.pH 植物酶植物酶4.5-6.5

18、4.5-6.5，動物酶，動物酶6.5-6.5-8 8，選擇與生理環(huán)境接近。，選擇與生理環(huán)境接近。ACP ACP pH4-7 ALP pH9-10pH4-7 ALP pH9-104.4.溫度溫度 動物酶動物酶35-4035-40度，植物酶度，植物酶40-6040-60度，升高度，升高1010度反應(yīng)速度增度反應(yīng)速度增加加1-21-2倍，倍，3737度誤差小于度誤差小于0.10.1度度5.5.激活劑抑制劑激活劑抑制劑 返回節(jié)返回節(jié) 酶活性濃度測定就是要使酶促反應(yīng)的初速度酶活性濃度測定就是要使酶促反應(yīng)的初速度（v v）達(dá)到最大速度）達(dá)到最大速度VmaxVmax，即在過量底物存在下的，即在過量底物存在下

19、的零級反應(yīng)期的速度，此時反應(yīng)速度與酶濃度零級反應(yīng)期的速度，此時反應(yīng)速度與酶濃度EE之之間存在線性關(guān)系。間存在線性關(guān)系。第四節(jié)第四節(jié) 酶活性濃度測定技術(shù)酶活性濃度測定技術(shù) 返回章返回章 1.1.按反應(yīng)時間分類按反應(yīng)時間分類: : 定時法定時法 不能保證整個反應(yīng)都在零級反應(yīng)期進(jìn)行，因為需不能保證整個反應(yīng)都在零級反應(yīng)期進(jìn)行，因為需要終止反應(yīng)。要終止反應(yīng)。 連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法 2.2.按檢測方法分類按檢測方法分類： 量氣法、分光光度法、熒光法量氣法、分光光度法、熒光法 其它方法（其它方法（ 放射性核素法、離子選擇電極法，旋光法、放射性核素法、離子選擇電極法，旋光法、極譜法、極譜法、HPLCHPLC或

20、生物發(fā)光法等）。或生物發(fā)光法等）。一、酶活性濃度測定方法一、酶活性濃度測定方法 返回節(jié)返回節(jié) Ex Ex 為待測酶，為待測酶，A A為底物，為底物，B B為中間產(chǎn)物。為中間產(chǎn)物。 A A、B B二物質(zhì)的變二物質(zhì)的變化無法直接監(jiān)測，此時可外加第二個酶化無法直接監(jiān)測，此時可外加第二個酶Ei(Ei(為指示酶為指示酶) )，其，其底物為底物為B B，反應(yīng)產(chǎn)物為，反應(yīng)產(chǎn)物為P P可直接測定。可直接測定。PBAEiEx二、酶偶聯(lián)法二、酶偶聯(lián)法 返回節(jié)返回節(jié) 酶偶聯(lián)反應(yīng)酶偶聯(lián)反應(yīng) 最簡單的模式為：最簡單的模式為： 輔助反應(yīng)輔助反應(yīng) 如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直

21、接偶聯(lián)，此時還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加其直接偶聯(lián)，此時還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連在一起，此反應(yīng)稱為輔助反應(yīng)。入另一種酶，將二者連在一起，此反應(yīng)稱為輔助反應(yīng)。模式為：模式為：PCBAEiEaEx 返回節(jié)返回節(jié) 其中，其中，B B、C C均為中間產(chǎn)物，均為中間產(chǎn)物，EaEa、EiEi都為工具酶。都為工具酶。最后最后一個酶稱指示酶一個酶稱指示酶EiEi，其他外加的酶都為輔助酶（，其他外加的酶都為輔助酶（EaEa）。）。酶偶聯(lián)法測定酶偶聯(lián)法測定ALTALT的吸光度變化圖的吸光度變化圖 返回節(jié)返回節(jié) 方法條件的選擇方法條件的選擇 盡可能采用連續(xù)監(jiān)測法；減少步驟盡可能采用連續(xù)監(jiān)

22、測法；減少步驟, , 化學(xué)試劑有一定純度化學(xué)試劑有一定純度, ,雙蒸水雙蒸水, ,使用雙試劑。使用雙試劑。 測定參數(shù)的設(shè)置測定參數(shù)的設(shè)置 方法類型、波長、樣品量與試劑量、方法類型、波長、樣品量與試劑量、 稀釋水量、試劑吸光度上下限、空白速率、反應(yīng)孵育時稀釋水量、試劑吸光度上下限、空白速率、反應(yīng)孵育時 間、延遲間、延遲, ,監(jiān)測時間、底物耗盡限額、線性范圍及計算監(jiān)測時間、底物耗盡限額、線性范圍及計算 因子因子F F值。值。 標(biāo)本的采集、運輸與保存標(biāo)本的采集、運輸與保存 影響因素：溶血、抗凝劑、溫度等。影響因素：溶血、抗凝劑、溫度等。 干擾因素的控制干擾因素的控制 反應(yīng)干擾。污染。底物自行發(fā)生反反

23、應(yīng)干擾。污染。底物自行發(fā)生反 應(yīng)。應(yīng)。三、血清酶活性濃度測定條件的選擇三、血清酶活性濃度測定條件的選擇 返回節(jié)返回節(jié) 測定參數(shù)的選擇測定參數(shù)的選擇u方法類型 終點法 連續(xù)監(jiān)測法u波長 吸光度最大的波長 雙波長注明主波長次波長雙波長能有效的消除干擾的影響u樣品量與試劑量 考慮靈敏度和測定上線 樣品:試劑=1:10 比例降低靈敏度下降 過高測定線性下降樣品需稀釋后復(fù)檢機會增多 返回節(jié)返回節(jié) u稀釋水量稀釋水量 目的:洗出粘附在采樣針內(nèi)壁上的微量血清 減少加樣誤差同時避免試劑間的交叉污染（酸性試劑）u試劑吸光度上線下線試劑吸光度上線下線 上線正向反應(yīng)求得比色杯的光徑如上線為0.5 0.7設(shè)置為0.3

24、5 下線負(fù)向反應(yīng)ALT下線為1.2 0.7比色杯設(shè)置為0.8u試劑空白速率試劑空白速率 試劑每批空白吸光度波動0.015A試劑在監(jiān)測過程中底物自動降解得到的結(jié)果以水為空白監(jiān)測樣品測定結(jié)果能自動扣除試劑空白數(shù)據(jù)u孵育時間孵育時間 自動分析儀應(yīng)選擇最大反應(yīng)時間一般為5分鐘終點法G,CHO,TG,TC必須測定酶試劑反應(yīng)達(dá)到終點時間因37度反應(yīng)慢u延遲試間延遲試間 連續(xù)監(jiān)測與終點法相同酶與底物混合后需要一定時間使酶激活直到線性反應(yīng)時間才能開始監(jiān)測（有時用工具酶將內(nèi)源性代謝物耗盡如ALT先試劑1將樣品中所含的丙酮酸消耗完然后加試劑2）單試劑法需30秒 輔酶越過，就越長u監(jiān)測時間監(jiān)測時間 90-120秒至

25、少4個點 少于3個點A不能稱為連續(xù)監(jiān)測法 不能計算線性度（不知是否為線性反應(yīng)）監(jiān)測時間過長容易發(fā)生低物耗盡 可測范圍變窄稀釋樣品過多u低物耗盡限額低物耗盡限額 兩法相同l 零點與監(jiān)測第一點吸光度的差額l 吸光度上升或下降至指定吸光度的數(shù)值超過限額說明樣品酶活性非常高低物耗盡隨后監(jiān)測吸光度不可靠應(yīng)稀釋樣品5-10倍u線性范圍線性范圍 按試劑質(zhì)量而定 超過范圍應(yīng)需樣品稀釋或增加樣品u線性度線性度 連續(xù)監(jiān)測法用線性大說明A之間不成線性超過限額說明低物不足監(jiān)測結(jié)果會變低 應(yīng)稀釋后重作 一般15儀器說明書uK K因子值因子值 升高線性范圍寬重復(fù)性差，降低線性范圍窄精密度好，與酶升高線性范圍寬重復(fù)性差，降

26、低線性范圍窄精密度好，與酶的參考值，測定時間和噪音有關(guān)，如的參考值，測定時間和噪音有關(guān)，如K K等于等于80008000，噪音，噪音0.001/0.001/分結(jié)果分結(jié)果誤差誤差8U/L8U/L，對于值比較低的結(jié)果，影響較大。，對于值比較低的結(jié)果，影響較大。 返回節(jié)返回節(jié) 標(biāo)本的采集、運輸與保存標(biāo)本的采集、運輸與保存u溶血溶血l 紅細(xì)胞內(nèi)紅細(xì)胞內(nèi)LDH,ACP,AST,KLDH,ACP,AST,K分別比血漿高分別比血漿高160160，6868，6 6，2323倍，倍，釋放釋放HBHB會影響比色法原理檢測方法注明樣品溶血會影響比色法原理檢測方法注明樣品溶血 u采集時間采集時間l 固定時間消除血液成

27、分晝夜變動n心梗肌紅動態(tài)監(jiān)測CK-MB48-72小時后恢復(fù)正常 u 采血體位采血體位l 站立時血管內(nèi)水會進(jìn)入組織液相對增高 大分子物質(zhì)與此相同 如ALB,TP,TG,TC,LDL,AST,ALP升高5-15，應(yīng)坐位5分后采集 返回節(jié)返回節(jié) 標(biāo)本的采集、運輸與保存標(biāo)本的采集、運輸與保存u壓脈帶壓脈帶 l pHpH下降下降K K+ +從細(xì)胞內(nèi)移出結(jié)果升高，應(yīng)時間為從細(xì)胞內(nèi)移出結(jié)果升高，應(yīng)時間為1 1分分 u采血針采血針 l 20號以上過小容易引起溶血 u抗凝劑抗凝劑 EDTA可去除CA等離子l 肝素鋰， 草酸鹽可抑制AMY ACP活性 標(biāo)本的采集、運輸與保存標(biāo)本的采集、運輸與保存u空氣光線影響空氣

28、光線影響 l 血氣分析不能有氣泡，空氣中氧高于動脈血，二氧化碳低于動脈血氣分析不能有氣泡，空氣中氧高于動脈血，二氧化碳低于動脈血，膽紅素吸收可見光發(fā)生分解作用，樣品在光線中血，膽紅素吸收可見光發(fā)生分解作用，樣品在光線中9 9小時總膽紅小時總膽紅素直膽紅素下降素直膽紅素下降4040，陽光直射，陽光直射1 1小時下降小時下降5050u樣品的唯一性標(biāo)志樣品的唯一性標(biāo)志 l 條碼、送檢應(yīng)分離血清3小時否則K升高G下降大部分酶在低溫中較穩(wěn)定u溫度溫度 l 反應(yīng)溫度37度，保存大部分酶室溫保存1-3天，但ACP37度1小時活性下降50 標(biāo)本的采集、運輸與保存標(biāo)本的采集、運輸與保存u干擾因素干擾因素 樣品是

29、體液（血清或血漿） l 其他酶和物質(zhì)的干擾ALT產(chǎn)物旁路效應(yīng)ALT催化生成的產(chǎn)物丙酮酸在LD催化下被消耗掉從而影響結(jié)果（賴氏法手工法）l 酶的污染試劑酶從動物或細(xì)菌中提取易污染其他酶l 非酶反應(yīng)低物不穩(wěn)定沒有酶的作用自行反應(yīng)l 分析容器的污染 金屬離子l 沉淀形成（脂類血清）酶活性單位酶活性單位慣用單位慣用單位 慣用單位是酶活性測定方法的建立者所規(guī)定的單慣用單位是酶活性測定方法的建立者所規(guī)定的單位。由于單位定義不同，參考范圍差別很大，難以進(jìn)行比較。位。由于單位定義不同，參考范圍差別很大，難以進(jìn)行比較。國際單位國際單位（IUIU） 在特定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化在特定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 1 mo

30、lmol底物底物的酶量為一個國際單位。的酶量為一個國際單位。 以以IUIU表示，表示，1IU=11IU=1 mol.minmol.min-1-1。KatalKatal單位單位 在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol1mol底物的酶量為底物的酶量為1kat1kat， 1kat=1mol.s 1kat=1mol.s-1-1。常用單位為。常用單位為 katalkatal或或 nkatal nkatal。 Kat Kat與與IUIU的換算關(guān)系為：的換算關(guān)系為： 1IU=11IU=1 molmolminmin-1-1=16.67nmol=16.67nmols s-1-1= 16.67n

31、katal= 16.67nkatal四、酶活性濃度的單位四、酶活性濃度的單位 返回節(jié)返回節(jié) 酶活性濃度單位酶活性濃度單位 臨床上酶活性濃度采用每單位體積（升）所含的酶活臨床上酶活性濃度采用每單位體積（升）所含的酶活性單位數(shù)表示。性單位數(shù)表示。 酶活性濃度單位的計算酶活性濃度單位的計算 連續(xù)監(jiān)測法根據(jù)摩爾消光系數(shù)進(jìn)行酶活性濃度的計算。連續(xù)監(jiān)測法根據(jù)摩爾消光系數(shù)進(jìn)行酶活性濃度的計算。 公式如下：公式如下：LvVALU610min/ 返回節(jié)返回節(jié) 用自動生化分析儀測定同一酶，條件固定時，從理論上用自動生化分析儀測定同一酶，條件固定時，從理論上來講來講V V、v v和和L L均為固定值，均為固定值，

32、為常數(shù)，則將公式為常數(shù)，則將公式 簡化為簡化為 如如LDLD活性濃度，已知活性濃度，已知NADHNADH的的 為為6.226.22 10103 3cmcm-1-1.mol.mol-1-1，血，血清量為清量為5050 l l，底物液為，底物液為1ml1ml，比色杯光徑為，比色杯光徑為1cm1cm，則，則 F=1.05F=1.05 10106 6/6.22/6.22 10 103 3 0.050.05 1=33761=3376FALUmin/LvVF610LvVALU610min/五、系數(shù)五、系數(shù)K K值的計算與應(yīng)用值的計算與應(yīng)用 返回節(jié)返回節(jié) 使用推薦方法和參考方法使用推薦方法和參考方法使用公認(rèn)

33、的酶校準(zhǔn)物或酶參考物使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)物或酶參考物標(biāo)準(zhǔn)化途徑標(biāo)準(zhǔn)化途徑l 建立原級參考方法建立原級參考方法 l 制備原級參考物制備原級參考物 l 建立參考實驗室網(wǎng)絡(luò)建立參考實驗室網(wǎng)絡(luò) 酶活性濃度測定的參考系統(tǒng)酶活性濃度測定的參考系統(tǒng)六、臨床酶學(xué)測定的標(biāo)準(zhǔn)化六、臨床酶學(xué)測定的標(biāo)準(zhǔn)化 返回節(jié)返回節(jié) 酶的免疫化學(xué)測定方法酶的免疫化學(xué)測定方法 放射免疫測定（放射免疫測定（RIARIA）、免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免）、免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測定（疫測定（CLIACLIA）、酶免疫測定（）、酶免疫測定（EIAEIA）、熒光酶免疫測）、熒光酶免疫測定（定（FEIAFEIA）。）。 免疫化學(xué)法的結(jié)果報告方式免疫化

34、學(xué)法的結(jié)果報告方式 （1 1）用酶活性濃度單位，結(jié)果以）用酶活性濃度單位，結(jié)果以U/LU/L表示。表示。 （2 2）用質(zhì)量濃度單位，結(jié)果直接用）用質(zhì)量濃度單位，結(jié)果直接用ng/mlng/ml或或 g/Lg/L表示。表示。 血清酶活性與酶質(zhì)量的變化的關(guān)系血清酶活性與酶質(zhì)量的變化的關(guān)系 注意兩者之間的差異，如注意兩者之間的差異，如CK-MBCK-MB活性與質(zhì)量不平行。活性與質(zhì)量不平行。 第五節(jié)第五節(jié) 酶的免疫化學(xué)測定酶的免疫化學(xué)測定 返回章返回章 第六節(jié)第六節(jié) 同工酶及亞型的測定同工酶及亞型的測定 返回章返回章 概念：概念： 同工酶同工酶是催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、是催化相同的化學(xué)反

35、應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、 理化性質(zhì)不同的一組酶。理化性質(zhì)不同的一組酶。 亞型亞型指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異形成的指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異形成的 多種形式的一類酶。往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入多種形式的一類酶。往往在基因編碼產(chǎn)物從細(xì)胞內(nèi)釋入 血漿時因肽酶作用降解而形成。血漿時因肽酶作用降解而形成。分類：分類： 簡單分類簡單分類原級同工酶和次級同工酶。原級同工酶和次級同工酶。 基因分類基因分類單基因決定的同工酶、復(fù)等位基因同工單基因決定的同工酶、復(fù)等位基因同工 酶、多基因決定的同工酶和修飾的同工酶等四類。酶、多基因決定的同工酶和修飾的同工酶等四類。 一、同工酶的概念及分

36、類一、同工酶的概念及分類 返回節(jié)返回節(jié) 第七節(jié)第七節(jié) 工具酶及其臨床應(yīng)用工具酶及其臨床應(yīng)用 返回章返回章 概念概念 作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性的酶稱為工具酶。的酶稱為工具酶。工具酶參與的指示反應(yīng)工具酶參與的指示反應(yīng) 偶聯(lián)偶聯(lián)H H2 2O O2 2工具酶及指示反應(yīng)：工具酶及指示反應(yīng)：如常用的如常用的TrinderTrinder反應(yīng)即被測物質(zhì)通過酶作用產(chǎn)生過氧化反應(yīng)即被測物質(zhì)通過酶作用產(chǎn)生過氧化氫，在氫，在4-4-氨基比林，過氧化氫酶存在下，生氨基比林，過氧化氫酶存在下，生成紅色醌亞胺化合物成紅色醌亞胺化合物 NAD(P)+NAD(P)+或或NAD(P)

37、HNAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反應(yīng)：示反應(yīng)：利用氧化利用氧化- -還原酶反應(yīng)使其連接到還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)H的正的正/ /逆反應(yīng)后，直接測定逆反應(yīng)后，直接測定NAD(P)HNAD(P)H的變化量。的變化量。一、工具酶一、工具酶 返回節(jié)返回節(jié) 二、代謝物的酶法測定二、代謝物的酶法測定 終點法終點法概念：概念： 在代謝物酶促反應(yīng)中，隨著時間的延續(xù)，待測物濃度逐漸在代謝物酶促反應(yīng)中，隨著時間的延續(xù)，待測物濃度逐漸減少而產(chǎn)物逐漸增多，一定時間后待測物全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，反減少而產(chǎn)物逐漸增多，一定時間后待測物全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，反應(yīng)趨

38、于平衡，測定反應(yīng)完全后待測物或產(chǎn)物變化的總量，即終應(yīng)趨于平衡，測定反應(yīng)完全后待測物或產(chǎn)物變化的總量，即終點法（又稱平衡法）。點法（又稱平衡法）。測定的基本條件：測定的基本條件： 待測物濃度待測物濃度SS應(yīng)遠(yuǎn)小于其米氏常數(shù)應(yīng)遠(yuǎn)小于其米氏常數(shù)KmKm，此時任何時刻的，此時任何時刻的反應(yīng)速度反應(yīng)速度 v=VS / Km v=VS / Km，呈一級反應(yīng)。，呈一級反應(yīng)。 反應(yīng)配方中所用酶量（反應(yīng)配方中所用酶量（V V）應(yīng)足夠大，而）應(yīng)足夠大，而KmKm應(yīng)小，以保證應(yīng)小，以保證有較快的反應(yīng)速度完成測定。有較快的反應(yīng)速度完成測定。 返回節(jié)返回節(jié) 與終點法相比，動態(tài)法與終點法相比，動態(tài)法測定中待測物無需完全轉(zhuǎn)

39、化，故工具酶測定中待測物無需完全轉(zhuǎn)化，故工具酶的用量較少，為了保證有足夠的測定線性，所用酶的的用量較少，為了保證有足夠的測定線性，所用酶的KmKm應(yīng)足夠應(yīng)足夠大。大。兩者對于測定儀器的要求不同兩者對于測定儀器的要求不同。終點法測定對于儀器的電噪聲。終點法測定對于儀器的電噪聲和溫控要求不嚴(yán)，而動態(tài)法要求儀器的電噪聲小，吸光度應(yīng)讀和溫控要求不嚴(yán)，而動態(tài)法要求儀器的電噪聲小，吸光度應(yīng)讀準(zhǔn)到準(zhǔn)到0.00010.0001，溫度變化，溫度變化0.120ULN)(20ULN)的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。 返回節(jié)返回節(jié) u注意事項 手工法手工法 l 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的配制,其不

40、穩(wěn)定見空氣易發(fā)生聚合反應(yīng),不會出現(xiàn)顯色反應(yīng),應(yīng)干燥器中過夜后再使用,基質(zhì)液稱量準(zhǔn)確,每批試劑的空白吸光度不應(yīng)超過0.015A,在室溫可保存2天,在4C冰箱可保存1周,一般血清中內(nèi)源性酮酸含量很少,成批標(biāo)本只需作一個空白,嚴(yán)重脂血黃疸溶血糖尿病酮癥酸中毒病人血中因含大量酮體引起吸光度增加應(yīng)作空白,賴氏法線性小于150卡門單位,ALT增高應(yīng)稀釋,加入試劑要準(zhǔn)速度一致.u注意事項注意事項連續(xù)監(jiān)測法連續(xù)監(jiān)測法 l空白測定值應(yīng)小于5U/L,血清不宜反復(fù)冰凍保存,血液混濁可影響測定結(jié)果或無法測定,應(yīng)避免溶血。ALT存在兩個副反應(yīng)， 血清中存在 a-酮酸能消耗NADH 血清中谷氨酸脫氫酶增高，在有氨存在條件

41、下能消耗NADH，在使用雙試劑法應(yīng)溫育期長，能有效消除干擾。 二、二、 - -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶 生化特性生化特性 -GT-GT或或GGT GGT 是一種含巰基的線粒體酶。是一種含巰基的線粒體酶。組織分布組織分布 分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織分布于腎、胰、肺、肝、腸和前列腺等多種組織中，其中以腎臟含量最多。中，其中以腎臟含量最多。 GGT GGT在細(xì)胞中有膜結(jié)合型（疏水型）和可溶型（親在細(xì)胞中有膜結(jié)合型（疏水型）和可溶型（親水型）兩種。水型）兩種。 血清中血清中GGTGGT主要來源于肝膽系統(tǒng)。主要來源于肝膽系統(tǒng)。 返回節(jié)返回節(jié) GGTGGT的測定方法的測

42、定方法 以往國內(nèi)多以以往國內(nèi)多以L-L- - -谷氨酰谷氨酰- - - -萘胺或萘胺或L-L- - -谷氨酰谷氨酰- -對硝基苯胺等人工合成底物進(jìn)行比色法測定（即重氮對硝基苯胺等人工合成底物進(jìn)行比色法測定（即重氮試劑法）。由于底物水溶性差，緩沖液和試劑法）。由于底物水溶性差，緩沖液和 pH pH 對結(jié)果對結(jié)果影響較大，現(xiàn)已較少應(yīng)用。目前國內(nèi)外多采用連續(xù)監(jiān)影響較大，現(xiàn)已較少應(yīng)用。目前國內(nèi)外多采用連續(xù)監(jiān)測法測定血清測法測定血清 -GT-GT活性。活性。 返回節(jié)返回節(jié) IFCCIFCC國際臨床化學(xué)學(xué)會國際臨床化學(xué)學(xué)會 參考方法參考方法 采用采用L-L- - -谷氨酰谷氨酰-3-3-羧基羧基- -對硝

43、基苯胺對硝基苯胺(GCNA)(GCNA)作為底物，作為底物，以甘氨酰甘氨酸（雙甘肽）作為以甘氨酰甘氨酸（雙甘肽）作為 - -谷氨酰基的受體。在谷氨酰基的受體。在pH7.7pH7.7的條件下，的條件下， -GT-GT催化底物生成催化底物生成 - -谷氨酰雙甘肽和黃谷氨酰雙甘肽和黃色的色的2-2-硝基硝基-5-5-氨基苯甲酸，在氨基苯甲酸，在410nm410nm波長處直接連續(xù)監(jiān)測，波長處直接連續(xù)監(jiān)測，吸光度的增高速率與吸光度的增高速率與 -GT-GT活性成正比關(guān)系。活性成正比關(guān)系。甘氨酰甘氨酸谷氨酰氨基苯甲酸硝基雙甘肽 LGCNAGGT52 返回節(jié)返回節(jié) GGTGGT測定的臨床意義測定的臨床意義(

44、1)(1)膽道疾病膽道疾病 膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻等升高明顯。膽石癥、膽道炎癥、肝外梗阻等升高明顯。(2)(2)肝實質(zhì)疾病肝實質(zhì)疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化時中度升高。肝炎、脂肪肝、肝硬化時中度升高。 慢性肝炎活動期慢性肝炎活動期GGTGGT多增高，非活動期則多正常。多增高，非活動期則多正常。 原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌時不同程度的增高。原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝癌時不同程度的增高。(3)(3)誘導(dǎo)作用誘導(dǎo)作用 對乙醇性中毒的判斷有一定的價值。對乙醇性中毒的判斷有一定的價值。 長期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者升高。長期接受巴比妥類藥物、含雌激素的避孕藥者升高。(4) (4) 同工酶同工酶 用醋酸纖維薄

45、膜電泳可將用醋酸纖維薄膜電泳可將GGTGGT同工酶分為同工酶分為GGTGGT1 1、GGTGGT2 2、GGTGGT3 3和和 GGT GGT4 4四種，正常人只有四種，正常人只有GGTGGT2 2和和GGTGGT3 3。 重癥肝膽疾病和肝癌時有重癥肝膽疾病和肝癌時有GGTGGT1 1出現(xiàn)；乙醇性肝壞死、膽總管結(jié)出現(xiàn)；乙醇性肝壞死、膽總管結(jié) 石及胰腺炎時石及胰腺炎時GGTGGT2 2增加；增加；GGTGGT4 4與膽紅素增高相關(guān)。與膽紅素增高相關(guān)。 返回節(jié)返回節(jié) 三、肌酸激酶及其同工酶三、肌酸激酶及其同工酶 生化特性生化特性 肌酸激酶為巰基酶，易受金屬離子肌酸激酶為巰基酶，易受金屬離子CaCa

46、2 2、CuCu2 2、ZnZn2 2、MnMn2 2等的抑制，等的抑制，MgMg2 2是是CKCK的必需激活劑。由兩種不同亞基（的必需激活劑。由兩種不同亞基（M M和和B B亞基）組成的二聚體。亞基）組成的二聚體。 按電泳速率的快慢分為：按電泳速率的快慢分為：CK-BBCK-BB（CKCK1 1）、）、CK-MBCK-MB（CKCK2 2）、）、CK-MMCK-MM（CKCK3 3）和）和CKCKMt(CKMt(CK4 4) )四種同工酶。四種同工酶。組織分布組織分布 廣泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦組廣泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦組織。織。 CK-BB CK-

47、BB在腦和脊髓內(nèi)含量最高稱為腦型同工酶。分為氧化在腦和脊髓內(nèi)含量最高稱為腦型同工酶。分為氧化型、中間型和還原型型、中間型和還原型3 3種亞型。種亞型。 CK-MB CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)稱為心型同工酶。分為主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)稱為心型同工酶。分為CK-MB1CK-MB2CK-MB1CK-MB2亞型。亞型。 骨骼肌中幾乎全部為骨骼肌中幾乎全部為CK-MMCK-MM，稱為肌型同工酶。分為，稱為肌型同工酶。分為CK-MM1CK-MM2CK-MM3CK-MM1CK-MM2CK-MM3亞型。亞型。 返回節(jié)返回節(jié) CKCK的測定方法的測定方法 有比色法、紫外分光光度法和熒光法等。由于以磷酸有比色法

48、、紫外分光光度法和熒光法等。由于以磷酸肌酸為底物的逆向反應(yīng)速度快，約為正向反應(yīng)速度的肌酸為底物的逆向反應(yīng)速度快，約為正向反應(yīng)速度的6 6倍，倍，所以采用逆向反應(yīng)進(jìn)行測定較為普及。如肌酸顯色法和酶偶所以采用逆向反應(yīng)進(jìn)行測定較為普及。如肌酸顯色法和酶偶聯(lián)法，其中以后者最常用，有兩種工具酶及指示酶參與反應(yīng)。聯(lián)法，其中以后者最常用，有兩種工具酶及指示酶參與反應(yīng)。 IFCCIFCC測定測定CKCK的參考方法為酶偶聯(lián)法。的參考方法為酶偶聯(lián)法。HKHK己糖激酶己糖激酶 G6PD6 G6PD6磷酸葡磷酸葡萄糖脫氫酶萄糖脫氫酶 HNADPHPDGNADPADPHKATPATPCKADP磷酸葡萄糖內(nèi)酯葡萄糖磷酸葡

49、萄糖磷酸葡萄糖肌酸磷酸肌酸6666 返回節(jié)返回節(jié) CKCK同工酶和亞型的測定方法同工酶和亞型的測定方法 臨床常規(guī)測定臨床常規(guī)測定CKCK同工酶多用電泳和免疫抑制法，但二同工酶多用電泳和免疫抑制法，但二法均會受溶血和巨法均會受溶血和巨CKCK的干擾，免疫抑制法還會受到的干擾，免疫抑制法還會受到CK-BBCK-BB的的干擾。干擾。 現(xiàn)推薦用免疫化學(xué)方法直接測定現(xiàn)推薦用免疫化學(xué)方法直接測定CK-MBmassCK-MBmass，可不受溶，可不受溶血和巨血和巨CKCK的干擾。的干擾。 CK CK同工酶亞型（同工酶亞型（CK-MMCK-MM亞型和亞型和CK-MBCK-MB亞型）多用瓊脂糖亞型）多用瓊脂糖凝

50、膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。凝膠高壓電泳和等電聚焦電泳等。 返回節(jié)返回節(jié) 正常和病理狀況時瓊脂糖凝膠電泳分析正常和病理狀況時瓊脂糖凝膠電泳分析血清血清CKCK同工酶可能出現(xiàn)的酶帶同工酶可能出現(xiàn)的酶帶 返回節(jié)返回節(jié) CKCK及其同工酶測定的臨床意義及其同工酶測定的臨床意義診斷診斷AMIAMI依據(jù)依據(jù) 表現(xiàn)胸疼，心電圖表現(xiàn)胸疼，心電圖Q Q波出現(xiàn)，血清酶變化。波出現(xiàn)，血清酶變化。主要用于早期診斷主要用于早期診斷AMI AMI （1 1） 血清血清CKCK總活力總活力 AMI AMI后后2 24h4h開始升高，開始升高，101024h24h達(dá)峰值，達(dá)峰值，3 34 4天恢復(fù)正天恢復(fù)正常。常。（2 2

51、）CKCK同工酶及亞型同工酶及亞型 AMI AMI胸痛發(fā)作后，血清胸痛發(fā)作后，血清CK-MBCK-MB的上升先于其的上升先于其CKCK總活性，總活性，CK- MB/CKCK- MB/CK0.030.03可診斷為可診斷為AMIAMI。 CK-MM CK-MM亞型的測定：以亞型的測定：以CK-MMCK-MM3 3/CK-MM/CK-MM1 11.01.0作為診斷作為診斷AMIAMI的的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)。 CK-MB CK-MB2 2亞型：在亞型：在AMIAMI早期診斷和判斷有無再灌注上同樣有很早期診斷和判斷有無再灌注上同樣有很高的靈敏度和特異性。一般以高的靈敏度和特異性。一般以CK-MBCK-MB2 2

52、1.9U/L1.9U/L或或CK-MBCK-MB2 2/CK-MB/CK-MB1 11.51.5作為作為AMIAMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。的診斷標(biāo)準(zhǔn)。 返回節(jié)返回節(jié) 四、乳酸脫氫酶及其同工酶四、乳酸脫氫酶及其同工酶 生化特性生化特性 乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的一種重要酶。乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的一種重要酶。LDLD除催除催化化L-L-乳酸外還可催化乳酸外還可催化-羥丁酸、羥丁酸、-酮丁酸進(jìn)行脫氫反酮丁酸進(jìn)行脫氫反應(yīng)。應(yīng)。組織分布組織分布 LDLD位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種含鋅的糖酵解酶。位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種含鋅的糖酵解酶。LDLD是是由由H H（心型）和（心型）和M M型（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體。型

53、（肌型）兩種不同亞基組成的四聚體。5 5種同工酶。種同工酶。 若用若用 - -羥基丁酸作為底物，可測定羥基丁酸作為底物，可測定H H亞基的活性亞基的活性。 返回節(jié)返回節(jié) LDLD的測定方法的測定方法目前多用連續(xù)監(jiān)測法。目前多用連續(xù)監(jiān)測法。LD-PLD-P法：以丙酮酸為底物（反應(yīng)方向法：以丙酮酸為底物（反應(yīng)方向P PL L）的逆向反應(yīng)）的逆向反應(yīng)（稱（稱LD-PLD-P法）。法）。LD-LLD-L法：以乳酸為底物（反應(yīng)方向法：以乳酸為底物（反應(yīng)方向L LP P）的順向反應(yīng)（稱）的順向反應(yīng)（稱LD-LLD-L法）。為法）。為IFCCIFCC參考方法（參考方法（pHpH為為9.49.4）。通過在）。

54、通過在340nm340nm波波長處監(jiān)測長處監(jiān)測NADNAD+ + 還原成還原成NADHNADH吸光度的增加速率而計算吸光度的增加速率而計算LDLD活性。活性。 HNADHNADLLD丙酮酸乳酸)( 返回節(jié)返回節(jié) LDLD同工酶的測定方法同工酶的測定方法 常用電泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以瓊脂糖凝膠常用電泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以瓊脂糖凝膠電泳法更多用。一般成年人存在如下規(guī)律：電泳法更多用。一般成年人存在如下規(guī)律：LDLD2 2LDLD1 1LDLD3 3LDLD4 4LDLD5 5，部分正常兒童血中可見，部分正常兒童血中可見LDLD1 1LDLD2 2。 返回節(jié)返回節(jié) L

55、DLD及其同工酶測定的臨床意義及其同工酶測定的臨床意義心肌梗死心肌梗死 LD LD心肌酶中升高最晚，持續(xù)時間長。心肌酶中升高最晚，持續(xù)時間長。急性肝炎、慢性活動性肝炎和肝癌急性肝炎、慢性活動性肝炎和肝癌( (尤其轉(zhuǎn)移性肝癌尤其轉(zhuǎn)移性肝癌) )時，時，LDLD明顯明顯升高。升高。LDLD同工酶主要用于同工酶主要用于AMIAMI和肝病的診斷和肝病的診斷 AMI LDAMI LD1 1升高最為顯著，升高最為顯著，LDLD1 1/LD/LD2 21 1，視為診斷，視為診斷AMIAMI的一個特異指的一個特異指標(biāo)。標(biāo)。 肝膽疾病肝膽疾病 LD LD5 5升高常表示有肝細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞性黃疸時升高常表示有肝

56、細(xì)胞壞死。肝細(xì)胞性黃疸時LDLD5 5LDLD4 4，阻塞性黃疽時，阻塞性黃疽時LDLD4 4LDLD5 5。 腫瘤腫瘤 肝癌肝癌( (尤其轉(zhuǎn)移癌尤其轉(zhuǎn)移癌) )時可伴有時可伴有LDLD4 4和和LDLD5 5明顯增高；白血病、明顯增高；白血病、膠原病時以膠原病時以LDLD3 3、LDLD4 4增高為主。增高為主。 惡性貧血惡性貧血 LD LD活性極度升高活性極度升高( (原始巨幼紅細(xì)胞可產(chǎn)生并釋放原始巨幼紅細(xì)胞可產(chǎn)生并釋放LD)LD)，伴有伴有LDLD1 1明顯升高，明顯升高，LDLD1 1LDLD2 2。 返回節(jié)返回節(jié) 返回節(jié)返回節(jié) 五、堿性磷酸酶及其同工酶五、堿性磷酸酶及其同工酶 生化特

57、性生化特性 堿性磷酸酶是一組底物特異性較低堿性磷酸酶是一組底物特異性較低, ,在堿性條件下（最適在堿性條件下（最適pHpH為為1010左右）能水解很多磷酸單酯化合物的酶。左右）能水解很多磷酸單酯化合物的酶。組織分布組織分布 ALP ALP廣泛分布定位于細(xì)胞膜表面，其含量依次為肝、腎、廣泛分布定位于細(xì)胞膜表面，其含量依次為肝、腎、胎盤、小腸、骨骼等。胎盤、小腸、骨骼等。 血清中的血清中的ALPALP主要來自肝臟和骨骼，是膽汁淤滯的酶學(xué)指主要來自肝臟和骨骼，是膽汁淤滯的酶學(xué)指標(biāo)。標(biāo)。 根據(jù)根據(jù)ALPALP的來源不同可以的來源不同可以3 3大類，即胎盤大類，即胎盤ALPALP、腸、腸ALPALP和和

58、肝肝/ /骨骨/ /腎腎ALPALP同工酶。在病理時還可能出現(xiàn)肝同工酶。在病理時還可能出現(xiàn)肝ALPALP和膽汁和膽汁ALPALP等等“高分子高分子ALPALP” ，以及一些和腫瘤有關(guān)的變異，以及一些和腫瘤有關(guān)的變異ALPALP，如，如ReganRegan、Nagao ALPNagao ALP等。等。 返回節(jié)返回節(jié) ALPALP的測定方法的測定方法(1)(1)磷酸苯二鈉比色法：磷酸苯二鈉比色法：測定測定ALPALP水解底物產(chǎn)生的酚。水解底物產(chǎn)生的酚。(2)(2)連續(xù)監(jiān)測法：連續(xù)監(jiān)測法：我國及我國及IFCCIFCC的推薦方法。的推薦方法。 PiAMPPNPAMPPNPPALP 返回節(jié)返回節(jié) ALP

59、ALP測定的臨床意義測定的臨床意義肝膽疾病肝膽疾病 各種肝內(nèi)、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾各種肝內(nèi)、外膽管阻塞引起的膽汁淤積性疾病，病，ALPALP明顯升高，且明顯升高，且ALPALP升高與膽紅素平行升高與膽紅素平行甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、甲亢、惡性骨損傷、佝僂病、PagetsPagets病、骨折病、骨折、指端肥大、指端肥大癥所致骨損傷等，均可引起癥所致骨損傷等，均可引起ALPALP活性升高，尤其是骨活性升高，尤其是骨ALPALP同同工酶的增高工酶的增高妊娠后期妊娠后期及兒童生長期及兒童生長期ALPALP增高增高血清血清ALPALP活性降低：活性降低：主要見于呆小病、維生素主要見于呆小病、維

60、生素C C缺乏癥、甲缺乏癥、甲狀腺功能低下、惡性貧血等。狀腺功能低下、惡性貧血等。 返回節(jié)返回節(jié) u注意事項lALP底物不應(yīng)含有游離酚，如有酚空白管顯紅色，說明磷酸苯二鈉已經(jīng)開始分解應(yīng)棄去。鐵氰化鉀中加入硼酸有穩(wěn)定作用，應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍(lán)綠色應(yīng)棄去。加入鐵氰化鉀后應(yīng)立即混勻否則顯色不完全，黃疸溶血血清應(yīng)分別作對照，一般血清可以共用對照管六、酸性磷酸酶及其同工酶六、酸性磷酸酶及其同工酶 生化特性生化特性 酸性磷酸酶是一組對底物專一性不強、在酸性條件下水酸性磷酸酶是一組對底物專一性不強、在酸性條件下水解各種正磷酸單酯的酶。解各種正磷酸單酯的酶。組織分布組織分布 ACP ACP主要存在于體內(nèi)所有細(xì)