1、5.2 目的基因片段與載體目的基因片段與載體DNA的連接的連接5.2.1 粘性末端粘性末端DNA片段的連接片段的連接 大多數的限制性核酸內切酶都能夠切割DNA分子，形成具有14個核苷酸的粘性末端。當載體和外源給體DNA用同樣的限制酶，或是用能夠產生相同的粘性末端的限制酶切割時，所形成的DNA末端就能夠彼此退火，并被T4連接酶共價地連接起來，形成重組體分子。當然，所選用的核酸酶對克隆載體DNA分子最好只具有一個識別位點，而且還是位于非必要的區段內。 5.2.1.1 插入式插入式 （單酶切）（單酶切） 這種方法引導的外源DNA片段的插入，可以有兩種彼此相反的取向，這對于基因克隆是很不方便的。 5.

2、2.1.2 取代式（雙酶切）取代式（雙酶切） 根據限制性核酸內切酶作用的性質，用兩種不同的限制酶同時消化一種特定的DNA分子，將會產生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。如果載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對限制酶切割，然后混合起來，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子。這就是所謂的定向克隆(directional cloning)技術，可以使外源DNA片段按一定的方向插入到載體分子上。 5.2.2 非互補粘性末端非互補粘性末端DNA片段的連接片段的連接 載體分子和給體DNA片段經不同的限制酶切割后，并不一定總能產生出互補的粘性末端，多為非互補的粘性末端或平末

3、端。對于平末端的DNA片段，可以用T4 DNA連接酶在一定的反應條件下進行連接；而具有非互補粘性末端的DNA片段，經單鏈特異性的S1核酸酶處理變成平末端之后，也可以使用T4 DNA連接酶進行有效連接。 但是，平末端DNA片段之間的連接作用，在效率上明顯地低于粘性末端之間的連接作用，而且重組之后便不能在原位刪除下來。現在基因克隆實驗中，常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。 5.2.2.1 同聚物加尾法同聚物加尾法 這種方法的核心是利用末端脫氧核苷酸轉移酶的特殊功能，此酶能夠將單核苷酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3OH上，該過程不需要模板。當反應物中只存在一

4、種脫氧核苷酸時，便能夠構成由同一種類型的核苷酸組成的尾巴，其長度可達100個核苷酸。 為了在平末端的DNA分子上產生出帶3OH的單鏈延伸末端，需要先用5特異的核酸外切酶，或者Pst I一類的內切酶處理DNA分子，以便移去少數幾個末端核苷酸。這樣在加有dATP和末端酶的反應混合物中，DNA分子的3末端將會出現單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸，這樣的延伸片段，稱之為poly(dA)尾巴。如果在反應混合物中加入的是dTTP而不是dATP，則形成poly(dT)尾巴。這兩種尾巴是互補的，同樣poly(dG)尾巴和poly(dC)尾巴也是互補的，可以使兩個不同的DNA分子彼此連接起來。 同聚物尾巴

5、的長度沒有嚴格限制，一般只要1040個殘基就夠了。但由于poly(dA)和poly(dT)，poly(dG)和poly(dC)通常是不會嚴格等長的，這樣形成的重組體DNA分子上便會留有缺口或裂口，因此需要用大腸桿菌DNA聚合酶I或Klenow大片段去填補，然后再用DNA連接酶封閉缺口。 這種修復反應不一定要在體外試管中進行，如果互補的一對同聚物尾巴長度超過20個核苷酸，它們結合形成的堿基對結構相當穩定，這樣的重組體分子可以直接導入受體細胞中，由細胞內部的DNA聚合酶和DNA連接酶對其進行修復。 5.2.2.2 用銜接物連接平末端用銜接物連接平末端DNA片段片段 所謂銜接物(linker)，是指

6、用化學方法合成的一段由1012個核苷酸組成的具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。 銜接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后再通過T4 DNA連接酶的作用使兩者連接起來；接著用適當的限制酶消化具銜接物的DNA分子和克隆載體分子，使二者都產生出了彼此互補的粘性末端，這樣就可以按照常規的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。 銜接物連接法兼具有同聚物加尾法和粘性末端法各自的優點，而且它可以根據實驗的要求，設計具有不同限制酶識別位點的銜接物，并大量制備，以增加其在體外連接反應混合物中的相應濃度，從而極大地提高了平末端DNA片

7、段之間的連接效率。 用銜接物連接法獲得的重組體分子，只要用同樣的限制酶在插入位點切割，便可以重新分離出原來的DNA插入片段，方便于克隆片斷的再刪除或進一步研究；而用T4 DNA連接酶的平末端連接法，或是同聚物加尾法構建的重組體DNA，就無法用原來的限制酶作特異性的切割，因而不能獲得插入的DNA片段。 5.2.2.3 用接頭連接平末端用接頭連接平末端DNA片段片段 在應用銜接物連接法時，如果待克隆的DNA片段或基因的內部，含有與所加的銜接物相同的限制位點，則在酶切消化銜接物產生粘性末端的同時，也會把克隆基因切成不同的片段，給后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。這時可以改用DNA接頭連接法。 DNA接

8、頭(adapter)是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具有粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。 接頭與銜接物的區別在于，接頭是一個具有粘性末端的短核苷酸雙鏈，它與平末端DNA連接后，不用經過切割就可以與載體相連。 為防止各個DNA接頭分子的粘性末端之間通過互補配對形成二聚體分子，通常要對DNA接頭末端的化學結構進行必要的修飾與改造，使其平末端仍與天然雙鏈DNA分子一樣，具有正常的5P和3OH末端結構，而其粘性末端5P則被修飾移走，被暴露出來的5OH所取代。 這樣，雖然兩個接頭分

9、子粘性末端之間仍具有互補堿基配對的能力，但因為DNA連接酶無法在5OH和3OH之間形成磷酸二酯鍵，而不會產生出穩定的二聚體分子。但它們的平末端照樣可以與平末端的外源DNA片段正常連接，只是在連接之后需用多核苷酸激酶處理，使異常的5OH末端恢復成正常的5P末端，讓其可以插入到適當的克隆載體分子上。 5.2.3 連接反應條件連接反應條件1. 為了使連接反應物中有盡可能多的外源DNA片段都能插入載體分子形成重組DNA ，必須盡量避免經限制酶切割后線性載體分子自身的再環化作用，以提高DNA片段的插入效率。采取的措施有：(1) 采用不同的限制酶進行切割，如BamH I和Hind III的粘性末端不同，自

10、身無法環化。 (2) 用堿性磷酸酶處理由限制酶消化產生的線性載體分子，除去載體DNA的5P末端，而留下5OH基團，這樣的線性載體分子，除非插入了外源DNA片段，否則就不能重新環化成有功能的載體分子。 (3) 使用同聚物加尾連接技術，可以自動地防止線性載體DNA分子自身再環化作用，這是因為切割后形成的線性DNA分子的兩個3OH末端，都被加上了具有同樣堿基結構的同聚物尾巴。 (4) 應用柯斯質粒，也可以防止質粒DNA分子發生自身的再環化作用。 防止線性載體分子發生自身再環化作用十分重要，因為載體分子的重建，會導致非重組噬菌斑或抗藥性菌落的大量產生，結果使非重組體克隆的比例大幅度上升，從而也增加了選

11、擇或篩選重組體克隆的工作量。 2. 在連接反應中，正確的選擇載體DNA和外源DNA之間的比例，是能否獲得高產量的重組體轉化子的一個重要因素。 (1) 用噬菌體或柯斯質粒作載體時，連接反應體系中載體DNA / 給體DNA的比例高，有利于重組體分子的形成，這是因為只有當給體DNA片段的兩個末端都同載體分子結合之后，才能被有效地包裝。 (2) 用質粒分子作為克隆的載體，載體DNA與給體DNA的比值為1時，有利于重組體分子的形成，因為這類重組體分子是由一個載體分子和一個給體DNA片段連接環化而成的。 3. 在體外連接反應中，DNA的總濃度對形成什么樣的DNA分子類型也會有所影響。一般低濃度（低于20g

12、 DNA/mL）時，DNA分子間的相互作用機會少，有利于環化作用；而高濃度的DNA（高于300400g DNA/mL），則有利于形成長的多連體DNA分子。 4. 連接反應的溫度也是影響連接效果的一個重要因素，研究表明，在4下保溫4h，沒有出現任何轉化子；而在26下連接1h就會產生很多的轉化子。事實上，在26下連接4h所得的轉化子數目，大約是4下連接23h的90%，而且是在4下連接4h的25倍以上。因而連接反應通常可以在室溫下進行。 16（用冰浴調節溫度），612小時。 5.3 重組體向宿主細胞的導入重組體向宿主細胞的導入 帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構成之后，需要導入適當的寄主細胞進行

13、繁殖，才能獲得大量的純一的重組體DNA分子，這一過程叫做基因的擴增。 將外源重組體分子導入受體細胞的途徑有多種，其中轉化（或轉染）和轉導主要適用于細菌一類的原核細胞和酵母這樣的低等真核細胞，而顯微注射和電穿孔則主要應用于高等動植物的真核細胞。 選定的寄主細胞必須具備使外源DNA進行復制的能力，而且還應該能夠表達由導入的重組體分子所提供的某種表型特征，這樣才有利于轉化子細胞的選擇與鑒定。 在所有的關于重組DNA的研究工作中，都使用了大腸桿菌K12突變體菌株，該菌株由于喪失了限制體系，故不會使導入細胞內的未經修飾的外源DNA發生降解作用。對于大腸桿菌寄主，無論是轉化還是轉導，都是十分有效的導入外源

14、DNA的手段。 5.3.1 重組體重組體DNA分子的轉化或轉染分子的轉化或轉染 轉化（transformation）嚴格地說是指將質粒DNA分子引入大腸桿菌細胞的過程；而轉染則是指噬菌體DNA分子轉入大腸桿菌細胞的過程。從本質上講，兩者并沒有根本的區別。 無論轉化還是轉染，其關鍵因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細胞，以提高膜的通透性。細菌轉化（或轉染）的具體操作程序是： (1) 選取新鮮幼嫩的受體細胞（如大腸桿菌HB101），培養一定時間使其OD550nm達到0.5；將培養好的細胞放在冰浴中冷凍10min，然后在4000 rpm下離心5min，收集沉淀細胞。 (2) 將沉淀細胞重新懸浮在預冷的無菌

15、的50mM CaCl2和TrisHCl (pH 8.0)中，放置冰浴5min，同樣離心收集沉淀細胞，重新懸浮，即成為感受態細胞，冰凍備用。 (3) 取出冰凍感受態細胞，加入連接反應混合物（重組DNA），在42水浴中作2min的熱刺激（讓外源DNA進入細胞內）。 (4) 如果使用的是噬菌體DNA（即轉染過程），那么可以將經過上述處理的細菌直接涂布在培養基平板上，于37下培養，此時已經捕獲了DNA的細胞經過一段時間后，會釋放出大量的子代噬菌體顆粒，如此重復下去，最終會在平板的細菌菌苔上形成噬菌斑。 (5) 如果使用的是質粒的DNA（即轉化過程），那么首先應將細菌放置在非選擇性的LB培養基中，37保

16、溫一段時間，以促使在轉化過程中獲得的新的表型（Tetr或Ampr）得到充分的表達，然后將此細菌培養物涂布在含有四環素或氨芐青霉素的選擇性平板上。 注意控制轉化條件，使每個細胞只進入一個重組體質粒DNA分子，在選擇性平板上一個轉化子細胞便會生長成為一個單菌落。每一個這樣的菌落都只含有一種來源于同一個轉化質粒的同源質粒群體，這樣的單菌落通常又稱為克隆。 在普通的轉化實驗中，每微克pBR322質粒DNA可以獲得106左右的轉化子菌落，每微克噬菌體的DNA可以獲得104106噬菌斑。然而當使用重組DNA分子進行轉化時，轉化的頻率一般要下降102104倍，這是因為：一方面由于載體分子同插入DNA片段間的

17、連接作用經常是無效的，結果便大大地降低了有功能的質粒或噬菌體DNA的實際數量；另一方面由于含有插入DNA片段的載體分子一般都比較大，這樣也會導致轉化（或轉染）的頻率再度明顯下降。 因此，為了提高轉化的頻率必須采取必要的措施，抑制那些不帶有外源插入DNA片段的噬菌體DNA或質粒DNA分子形成轉化子菌落。應用堿性磷酸酶處理法，可以阻止不帶有插入DNA片段的載體分子發生自身再環化的作用，從而提高了轉化效率。 5.3.2 重組體的體外包裝及重組體的體外包裝及 噬菌體的轉導噬菌體的轉導 另一種將外源重組DNA分子導入寄主細胞的方法，即所謂的體外包裝顆粒的轉導，它先將重組的噬菌體DNA或重組的柯斯載體DN

18、A，包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒，然后經由在受體細胞表面上的 DNA接受器位點，使這些帶有目的基因序列的重組體DNA注入大腸桿菌寄主細胞。 在第四章中已經討論過，將外源重組的 DNA包裝成為具有感染活性的噬菌體顆粒，需要從兩株對噬菌體溶源性的大腸桿菌中制備出一對互補的提取物。例如，在噬菌體外殼蛋白質基因A和E發生了無義突變的兩個溶源性菌株（如NS1128和433），或者是在噬菌體基因D和E發生了無義突變的兩個溶源性菌株（如BHB2690和2688）。 從突變體D菌株純化的蛋白質提取物，含有大量未成熟的噬菌體頭部前體顆粒，從突變體A菌株純化的蛋白質提取物，同樣也含有大量中空的頭部前體顆粒，而從突變體E菌株純化的蛋白質提取物中，積累了大量的尾部蛋白質。因此，E菌株的提取物可同另一種含有中空的頭部前體顆粒的D菌株（或A菌株）的提取物互補，完成噬菌體的形態建成。 在良好的體外包裝反應條件下，每微克野生