1、防己黃芪湯加減對急性脊髓損傷大鼠的組織形態學影響               作者：高益斌 楊米雄 葉紅明【摘要】  目的研究活血利水中藥對脊髓急性損傷的治療效果及其對脊髓組織病理改變的影響，探討其作用機制 方法隨機將120只脊髓損傷造模后的大鼠隨機分為復方組、方組、方組和激素組。前三者和激素組術后分別給予中藥治療和甲基強地松龍，于術后24h、7d、14d、21d、28d觀察各組大鼠脊髓運動功能恢復、脊髓局部鈣離子濃度變化及脊髓組織學改變。結果復方組脊髓運

2、動功能評分、及抑制鈣離子濃度優于激素組；復方組的病變與方、方組相比，有縮小病灶的表現。結論中藥與激素在抑制脊髓損傷的進程中，能保護神經組織免受損傷、抑制BNDF增生及鈣離子濃度上發揮有益作用。從功能和形態上證實中藥較激素在近期治療的類似性及遠期療效的有效性。 【關鍵詞】  脊髓損傷 中醫藥治療 腦源性神經生長因子 大鼠Abstract: Objective To evaluate the efficacy of Chinese medicine of stimulating blood circulation and reducing edema on treating acute

3、spinal cord injury, and discuss its functions mechanism by observing the dynamic pathological changes of spinal cord. Methods120 SD rats were divided into four groups:fufang group, fanggroup, fanggroup and methylprednisolone treated group. The modified method was adopted to make the models of spinal

4、 cord injury. The functional recovery of spinal cord, Ca2+ density and the pathological changes were observed dynamically in each group.Result The functional recovery of spinal cord was promoted, the damage and Ca2+ density were reduced. The vacuole area was diminished in spinal cord in the fufang g

5、roup. It also inhabited the secondary inflammation.Conclusion The benefited effects, inhibiting the pathological process of the damage, were preserving the neuron and promoting the proliferation of mesenchymal cell, resisting BDNF proliferation and Ca2+ density were observed in the fufang group. The

6、 efficacy of TCM and MP was proved by the functional evaluation and the morphologic observation not only in actual period but in long term.Key words: spinal injury; traditional Chinese medicine therapy; BDNF; rat   急性脊髓損傷(ASCI)在臨床上多見，致癱率高，其有兩種創傷機制作用于脊髓，既原發性損傷及在其基礎上發展起來的繼發性損傷，如何防止繼發性損傷的發生、發

7、展是目前研究的熱點。本實驗通過相關指標來評定防己黃芪湯加減對急性脊髓損傷的治療效果，為臨床應用提供實驗依據。1  材料與方法11  藥物與試劑111  藥物  防己黃芪湯加減(方)：(防己12g，黃芪15g，三七6g，白術9g，丹參15g，人參6g，甘草6g，生姜5g，大棗6g。八珍湯加減(方)：(當歸9g，川芎9g，白芍9g，熟地9g，人參9g，茯苓9g，甘草9g，續斷9g，丹參15g。藥材購自浙江省中醫院。將上藥加水500ml用中火反復煎煮成濃縮溶液，使每1ml水溶液相當于10g生藥。甲基強地松龍，注射劑量30mg/kg。112  試劑&#

8、160; A：第一抗體GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein)Ab4，美國Neomarkers公司；B：即用型ENVISION試劑盒：DAKO（丹麥）；C：DAB顯色劑：SIGMA（美國）；D：緩沖液：PBS PH74 0。1M；枸櫞酸鹽緩沖液（A液：枸櫞酸2101G，DW1000ml；B液：枸櫞酸鈉2941G，DW1000ml，枸櫞酸鹽緩沖液由A液及B液和DW按要求配合成PH值為6.0）。         12  動物及造模  120只SD大鼠，雌雄不拘，體重

9、240300g, 由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。采用胥少汀脊髓半橫切模型法1制作脊髓損傷模型。室溫控制于1925。大鼠用2%戊巴比妥鈉按45mg/kg腹腔麻醉達成后，俯臥位固定，以T9為中心，顯露T9T11椎板和棘突，切除椎板和棘突，保護硬脊膜。注意術中無菌及細致性操作。術中用改良針刀統一行T11左脊髓半橫切，可見大鼠下肢強烈抽搐及尾巴甩動，強調以術后損傷側下肢出現完全癱瘓作為造模成功的標志。術野切口常規用稀PVP碘水及慶大霉素沖洗三遍。徹底止血后依次縫合肌肉、皮膚，關閉切口，切口表面涂以青霉素液，用無菌創可貼保護。術后肌注青霉素8萬U/只，共3d。每日擠壓膀胱2次，直到710后膀胱功能恢

10、復為止。術后注意籠內及時更換干燥消毒木屑墊料以保持干燥清潔，觀察切口有無血腫、有無尿潴留、血尿、腹腔內出血、感染等并發癥。13  分組與處理  120只大鼠在脊髓損傷造模術后按隨機數字表分為復方組、方組、方組、激素組，每組動物30只。每日用藥量按成人劑量的1/50，由胃管灌入。麻醉蘇醒后30min灌藥1次，每次灌服15ml，每日用藥3次，術后第8天開始改為每日2次，劑量不變。復方組大鼠于術后1h開始注射方，分別于術后24h、7d各隨機處死6只。第8天開始改灌方，再分別于術后14d、21d、28d再各隨機處死6只；方組同復方組，但于第8天開始改為灌服生理鹽水；方組術后1h開始

11、灌生理鹽水，第8天開始改為灌方；激素組于術后開始肌注甲強龍(30mg/kg)。2  結果21  光鏡觀察211  復方組  傷后24h見灰質中央管附近白質出血，組織水腫，損傷部分神經細胞固縮壞死（圖1）；傷后7d間質出血灶周圍纖維間可見中性粒細胞，近中央管灰質部分水腫、壞死，存留大部分灰質內可見正常神經細胞，HE染色呈均勻淺紅色，可見廣泛分布的缺血性改變的神經細胞，尼氏體減少，胞核固縮，核仁部分固縮，少數核溶解，BDNF數量增加（圖2）；傷后14d病損處出現軟化灶，水腫較前減輕明顯，能見少量的神經纖維，間質中有少許淋巴與單核細胞，BDNF增生明顯；傷后2

12、1d可見大部神經細胞存在，脊髓結構清晰可辯，白質區可見少許膠質瘢痕，BDNF增生減慢（圖3、4）。圖1、2  神經細胞固縮壞死(略)圖3、4  白質區可見少許膠質瘢痕(略)212  方、方組與復方組相比，方、方組的改變不大。方組大鼠脊髓損傷術后24h組織出血明顯，細胞空泡變性，部分細胞核固縮消失、纖維絲斷裂；術后714d，水腫程度減輕不明顯，出血灶及神經元數目減少，BDNF增生明顯，與同時期復方組相比組織壞死及空泡樣變程度較重(圖5)；14d以后所示神經因子細胞分布均勻，排列較規則，組織空泡壞死變較輕(圖6)。圖5、6  組織壞死、空泡祥變 (略)圖7、

13、8  僅見少許BDNF增生(略)213  激素組  與復方組比較，大鼠損傷24h后出血灶散在，組織水腫、細胞空泡變性同復方組相似，大部分神經細胞形態基本正常，呈多角形，脊髓后角損傷嚴重(圖7 HE免疫組化×100)；術后714d組織輕度疏松水腫，細胞核無明顯固縮，神經因子結構基本完整，神經纖維極性完整，可見節細胞與神經纖維連接，僅見少許BDNF增生 (圖8 免疫組化×100)；2周以后，脊髓組織結構清晰，后角部分恢復，灰質中空腔面積較小，BDNF增生不明顯(圖9  免疫組化×100)22  電鏡觀察  正

14、常大鼠的脊髓神經元胞體的超微結構保存良好，胞內有清楚的線粒體、成團的粗面內質網、分散的滑面內質網及高爾基復合體等細胞器。復方組術后24h電鏡可觀察到脊髓白質脫髓鞘區神經軸突變性，不規則斷裂，線粒體和內質網腫脹，BDNF細胞核內染色邊聚，(圖9、10)7d后可見損傷區及其鄰近區的核周體呈暗、亮變性及壞死，多數神經細胞增生聚集，后纖維瘢痕化（圖11、12）。圖912  BDNF細胞核邊聚、后纖維瘢痕化(略)3  討論神經生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)家族成員是主要的靶源性神經營養因子，由靶組織產生，通過軸突末端受體介導，經神經細胞軸突逆行運輸到胞體，對神

15、經細胞的存活、分化和功能表達起著重要的作用。近年來的研究發現作為神經營養因子效應細胞的神經細胞，其本身亦具有產生神經營養因子的能力，即神經營養因子的自分泌作用。BDNF是廣譜的神經營養因子,對脊髓運動神經元具有神經營養作用，能促進其存活、分化及功能表達，也能挽救損傷的脊髓運動神經元和感覺神經元。   脊髓損傷后組織壞死與修復具有不一致性,既破壞與修復過程各有其獨立系統。換句話說，盡管組織壞死對修復產生不利影響，但一旦組織壞死過程停止后，不意味著肯定能產生有效的組織修復。本實驗研究發現，在術后2周觀察過程中，除了單核細胞和中性粒細胞減少外，少見有益的神經元和神經纖維的生長。提示早期治療的關鍵在于減輕神經元及其纖維的損傷程度、減少其損傷數量，盡量降低腦源性神經生長因子的增生。本實驗顯示，早期的抗炎治療能減輕脊髓的進行性壞死，降低其繼發性損傷程度。術后不久運動功能的提高可能只是反映了殘存組織的功能代償而不是有組織再生。因為研究顯示，術后如殘留515的脊髓組織即可促使運動功能恢復，況且大鼠的代償能力很強，更能早期恢復運動功能。從本實驗的病理學研究可知，相比于方、方組，復方組與激素組大鼠脊髓在損傷后炎性細胞浸潤的范圍較小、損傷程度較輕。提示防己黃芪湯與甲基強的松龍可明顯抑制脊髓橫斷損傷后