1、超能量運動引起心肌損傷探討     前言無論是人體實驗還是動物實驗，均發現長時間大強度運動可引起機體心肌損傷，以往關于抗運動性心肌損傷方面的研究，主要是采用藥物干預來進行。但就現有文獻資料來看，用來干預運動性心肌損傷的藥物種類較多且相互之間缺乏系統性比較研究，此外，藥物對機體一些不可預測的效應也尚未明了，這些都給將藥物干預運用到運動實踐中帶來很大問題。大量運動訓練實踐及運動醫學研究表明，運動是一把“雙刃劍”，雖然過于劇烈的運動對機體結構與功能有害，但適宜的運動能使機體組織發生良性適應性變化。關于運動引起的心臟保護作用的認識始于流行病學研究，研究發現，運動

2、能減少冠心病發生率和死亡率。年，等正式提出了運動預處理（，）概念。運動預處理（）是指運動鍛煉能增強心臟對缺血再灌注刺激的耐受性。動物在體心臟實驗發現，劇烈運動引起大鼠心電圖出現點下移、波、波及波幅值改變，弓背下壓等變化，心肌發生急性缺血；通過電超速驅動模擬大運動負荷刺激離體心臟后，可直接觀察到心肌梗死的缺血性損傷表現。目前，國內關于對運動性心肌損傷干預研究尚處于試探性階段。本研究通過反映心肌損傷的血液特異性敏感指標心肌肌鈣蛋白（，）及心肌型肌酸激酶（，）指標的檢測來反映大負荷運動引起的心肌損傷及觀察運動預處理（）對其的干預作用。病理生理學研究提出缺血再灌注損傷機制主要有自由基、鈣超載及能量代謝

3、障礙等學說，運動醫學界在對大負荷運動引起的心肌損傷研究過程中也有類似發現。本研究同步檢測心肌超氧化物歧化酶（，）和反映心肌自由基水平的丙二醛（，）指標、心肌內和三磷酸腺苷（，）及心肌細胞膜鈉鉀泵（）、鈣泵（）指標，來探討對大負荷運動引起的心肌損傷干預作用的可能機制。研究對象與方法研究對象成年雄性（）大鼠只，體重±，由四川大學華西醫學院實驗動物中心提供。大鼠自購回后在標準嚙齒目動物飼養籠內分籠喂養，自由攝食飲水。保證通風條件良好，室溫控制在，相對濕度，自然光照。研究方法動物分組與運動方式將只大鼠適應性喂養周后，隨機分為安靜對照組（組，）、運動預處理對照組（組，）、單純大負荷運動組（組，

4、）與運動預處理大負荷運動組（組，）。組與組又根據大負荷運動后即刻、個時相，各隨機分為組，分別依次記為單純大負荷運動后即刻組（組，）、單純大負荷運動后組（組，）、單純大負荷運動后組（組，）與運動預處理大負荷運動后即刻組（組，）、運動預處理大負荷運動后組（組，）、運動預處理大負荷運動后組（組，）。組不進行運動訓練；組與組、組進行跑臺運動（跑臺為天津產跑道小動物跑臺），運動強度參考標準制定。組運動方案：以坡度為°、速度為的強度完成每天持續、為期周（天周）的長期中等負荷跑臺運動。組與組運動方案：組以坡度為°、速度為的強度完成每天持續、為期周（天周）的長期中等負荷跑臺運動，在末次運動

5、后與組一起，以坡度為°、速度為的強度進行一次性大負荷跑臺運動，直至大鼠出現趴伏喘息，暫時對聲、電、機械刺激均無逃避反應，即終止運動。測試樣品的制備運動預處理對照組（組）在按中等運動負荷方案末次運動后時、組與組大負荷運動后的各時相小組、與、分別在相應時相，與安靜對照組（組）一道分別用戊巴比妥納腹腔麻醉，股動脈取血后，立即處死取心臟（冰浴中進行）。所取血以離心，取血清，用于心肌肌鈣蛋白（）、肌酸激酶同工酶（）指標的測定。取心室肌，用液充分洗盡殘留血液，橫切為前、中、后部分。其中前部分（約）用于細胞膜的制備，中間部分（約）用于、及指標測試樣本制備，后部分（約）用于大鼠心肌樣品的制備。心肌、

6、及指標測試樣本制備：將心室肌組織制成的組織勻漿，以離心，取上清液，用于、超氧化物歧化酶（）活性及丙二醛（）指標的測定。心肌測試樣品的制備：制備心肌測試樣品時先對心肌組織稱重并做記錄，然后在沸水浴中剪碎并保持在沸水浴中煮，冷卻后勻漿，用緩沖液（甘氨酰甘氨酸，）定容至，高速臺式離心機離心（、），取上清液，即為提取的心肌樣本，冰箱中保存待測。制備心肌樣品所需甘氨酰甘氨酸、購自美國公司。心肌細胞膜制備：按照南京建成生物有限公司的方法分級離心（，）制備。取心室前壁肌，去掉心內、外膜后稱重，加入倍的試劑（蔗糖，咪唑，）用內切式勻漿機在冰浴中剪碎勻漿，制成勻漿濾液，兩層紗布過濾后，離心取沉淀加入到試劑中，離

7、心次取沉淀加入到試劑尿素，咪唑，（），中混勻，放置后，離心取沉淀加入到試劑（咪唑，組氨基酸，）中，離心次取沉淀即心肌細胞膜懸于約試劑（咪唑，組氨基酸，）中，置中保存，內測酶活性。血清指標與心肌、及細胞膜指標檢測方法血清濃度采用法測定，濃度采用免疫抑制法測定。心肌活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，含量采用法測定，濃度采用偶氮胂法測定。心肌細胞膜、活性采用定磷法測定。試劑盒由美國公司提供；試劑盒由北京中生北控生物科技股份有限公式提供；試劑盒及試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；鈣（）試劑盒由四川省邁克科技有限責任公司提供。心肌指標檢測方法心肌含量采用高效液相色譜儀法測定。取心肌提取樣本，加入濃度為高氯

8、酸（分析純），靜置后，以×（）離心。取上清液，加入濃度為高氯酸，調節其值至，×（）離心，取上清液用于心肌含量測試。測試儀器為美國高效液相色譜儀（，）。高效液相色譜儀測試含量的色譜條件：美國色譜分析柱（，×），柱溫為；流動相為的緩沖鹽溶液乙腈，緩沖鹽溶液的配置：取適量的溶液（，四丁基氫氧化銨），用溶液（，四丁基氫氧化銨）調至；流速；紫外檢測波長為；進樣體積為。采用外標法定量。將標準品定量分析后獲得的回歸方程和相關系數：對處理好的本研究中大鼠心肌樣品溶液進行測定，記錄其的峰面積，代入上述方程計算后，獲得各樣品液的質量濃度。經換算后，得到各組大鼠心肌組織中的含量。標準品

9、的色譜圖如圖所示，的反應時間（）為。圖為本研究中一只大鼠心肌樣品色譜圖，的反應時間（）為。標準品，四丁基氫氧化銨，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，氫氧化鈉，高氯酸（分析純），均購自美國公司。實驗所需超純水由美國超純水器制得。統計學分析實驗所得數據用“均數±標準差”（±）表示，統計分析使用版統計分析軟件完成。血清心肌損傷指標、心肌指標及心肌細胞膜指標水平的比較均采用單因素方差分析（），在方差齊性的情況下用（）法進行后效檢驗，方差不齊性的情況下用方法進行后效檢驗；組與組大鼠大負荷跑臺運動持續時間的統計分析采用獨立樣本檢驗。以作為差異具有顯著性的標準，以作為差異具有非常顯著性的標準。研究

10、結果大鼠大負荷跑臺運動持續時間比較結果如表所示，單純大負荷運動組（組）、運動預處理大負荷運動組（組）大鼠以設定的運動強度完成一次性大負荷跑臺運動至最后不能再堅持運動時，兩組大鼠大負荷跑臺運動持續時間具顯著性差異，組大鼠明顯長于組。各組大鼠血清心肌損傷指標、濃度比較結果與安靜對照組（組）相比，組大鼠大負荷運動后即刻（）、（組）及（組）血清、濃度均明顯升高，具非常顯著性差異；其中，組變化最為明顯，與其他組有非常顯著性差異。雖然組大鼠大負荷運動后相小組血清、濃度也明顯升高，以運動后（組）最為明顯；但組大鼠大負荷運動后各時相小組的升高幅度均不如組大負荷運動后各時相小組，具顯著或非常顯著性差異（表、圖、

11、圖）。與安靜對照組（組）相比，運動預處理對照組（組）活性明顯增高，具顯著性差異。組與組大鼠大負荷運動后各時相小組的心肌活性均明顯降低、含量均明顯升高，與運動前均具非常顯著性差異；其中，運動后時相組（組或組）比其他個時相小組活性更低、含量更高，具非常顯著性差異。從大負荷運動后各時相小組的兩兩對應比較來看，運動預處理對大負荷運動引起的活性下降、含量升高具一定預防作用（表、圖、圖）。各組大鼠心肌活性、含量、濃度與含量比較結果組與組大鼠大負荷運動后心肌濃度明顯升高，運動后各時相小組與運動前相比，均具非常顯著性差異；其中，運動后時相組（組或組）比其他個時相小組變化更為明顯，具非常顯著性差異；從大負荷運動

12、后各時相小組的兩兩對應比較來看，運動預處理可明顯減輕大負荷運動后濃度的升高程度（表、圖）。組與組大鼠大負荷運動后即刻（組、組）心肌含量明顯下降，與運動前相比具非常顯著性差異；運動后（組、組）、運動后（組、組）表現出逐漸恢復的勢態。從大負荷運動后各時相小組的兩兩對應比較來看，運動預處理對大負荷運動引起的含量下降具一定預防作用（表、圖）。各組大鼠心肌細胞膜、活性比較結果組與組大鼠在大負荷運動后即刻（組、組）心肌細胞膜、活性明顯下降，與運動前相比具非常顯著性差異；在運動后（組或組）均進一步下降，與運動后即刻相比具非常顯著性差異；在運動后（組或組）有不同程度的恢復。從組與組運動后同時相小組的兩兩比較來

13、看，運動預處理對大負荷運動引起的心肌細胞膜、活性下降具一定預防作用（表）。討論運動預處理方案的討論臨床上發現，心肌缺血可造成心肌損傷，然而，心肌在恢復供血過程中損傷進一步加劇，這種現象被稱之為心肌缺血再灌注損傷。在對缺血性心肌病基礎實驗研究過程中發現，心肌在經過短暫缺血后能夠增加其對缺血的耐受現象，稱為缺血預處理（，）現象。然而，如何將效應真正運用到臨床實踐上也是個不小的難題。隨著對深入研究，發現運動有類似心臟保護效應，運動預處理（）的概念也被正式提出。近年來，一系列動物實驗研究表明，耐力運動能抗心肌缺血再灌注損傷，而且各年齡段表現一致。實際上，關于運動預處理的運動負荷尚沒有明確，間歇性大強度

14、運動、中等強度的適量運動都能抗心肌缺血再灌注損傷。在國內，有關運動預處理的研究尚處于摸索階段。動物在體、離體心臟實驗均發現，大負荷運動可引起心肌缺血，。與病理性心肌缺血不同的是：運動引起機體各器官系統缺血，是在機體保護性抑制系統監控下發生的一個主動缺氧過程，當無法忍受缺氧刺激時，機體將通過降低運動強度或完全停止運動來減少缺血程度，從而避免因過度缺血缺氧導致結構功能的不可逆改變。大量研究表明，大負荷運動引起的心肌損傷與病理性心肌缺血再灌注損傷極其相似。運動醫學界就如何提高心肌對大負荷運動刺激的耐受性做了一些相關研究。有文獻指出，在高原或模擬高原環境進行運動訓練以及運動前的熱身（）等，很可能是因為

15、心肌預缺血缺氧等因素所誘發的所謂現象，運動員便能持續進行較長時間、更劇烈的運動。本研究也發現，后大鼠進行大強度運動至不能再堅持運動時，運動所持續時間明顯延長。張鈞等研究發現，周中等負荷運動可降低大鼠心肌長時間劇烈運動后脂質過氧化水平，減少脂褐素的產生。鄭兵等研究發現，間歇性大強度運動能改善長時間劇烈運動后大鼠心肌抗氧化能力的下降、降低脂質過氧化水平及減少血清肌酸激酶的出現。這些是都是對的另一種詮釋。本研究在前人的研究基礎上進行運動預處理方案的探索，基于健身角度的思考選擇長期中等負荷運動作為方案。本實驗中大鼠運動強度依據標準制定。根據標準推算，本研究中體重±的大鼠，在坡度為°

16、、速度為的情況下進行跑臺運動，運動強度約為最大耗氧量強度，屬于大強度；、兩種組大鼠最后以此強度進行一次性大負荷跑臺運動，至不能再堅持運動時，分別持續了±和±，表明大鼠完成了大負荷運動。而本實驗中大鼠在坡度為°、速度為的情況下進行跑臺運動，運動強度約為最大耗氧量強度，為中等強度。最終，本實驗中的長期中等負荷方案定為坡度為°、速度為的中等運動強度，天、天周，共周。大負荷運動后血清心肌損傷指標變化及運動預處理對其干預作用心肌型肌酸激酶（）是由和亞基構成的雜化型二聚體，主要存在于心肌細胞的外漿層，是心肌酶譜中的特異性酶，血液是診斷心肌梗死的敏感指標。曾一度被認為

17、是診斷心肌損傷尤其是急性心肌梗死（）的“金指標”，其出現時間較傳統酶學時間要早，特異性和敏感度也相對較高。在我國，以往對人體的運動性心肌受損的檢測指標還是血清，但由于在其檢測中會受到來自受損骨骼肌的強烈干擾，以血清濃度變化作為心肌受損的診斷依據受到一定程度的質疑。近年來，隨著對心肌肌鈣蛋白（，）的深入研究，發現可以更敏感特異性的反應心肌損傷。心肌微小損傷時血清濃度就明顯升高。正逐步取代成為心肌損傷特別是診斷的“金標準”。心肌肌鈣蛋白（）由心肌肌鈣蛋白（，）、心肌肌鈣蛋白（，）及心肌肌鈣蛋白（，）種亞單位組成。無論是還是，心肌微小損傷后，在血清中都可以檢測到明顯變化；相比較而言，更能及時特異地反

18、映出心肌的微損傷。等發現，鐵人三項運動能引起人體血液、濃度升高。佘軍標等發現，田徑運動員其血液濃度在長時間大強度運動后明顯升高。而在動物實驗方面，已有大量研究表明，運動引起機體心肌細胞超微結構損傷及血液與、濃度升高等。有研究表明，大負荷運動后大鼠心肌濃度在運動后即刻明顯升高，在運動后最初一段時間內進一步升高，但在運動后已有明顯恢復。等總結指出：運動，尤其是長時間大強度運動引起的血液、濃度升高已有很多文獻報道，但不論是人體實驗還是動物實驗，由運動引起的血液、濃度升高現象在運動后后消失。本實驗結果發現，無論是單純力竭運動組（組）、還是運動預處理力竭運動組（組）大鼠，大負荷運動后即刻血清與濃度明顯升

19、高，且在運動后時進一步升高，而在運動后明顯得到恢復。這表明本實驗中的大負荷跑臺運動引起大鼠心肌損傷：在運動后即刻就已損傷，而在運動后最初一段時間內損傷加重，但在運動后時已處于恢復過程中。從組、組大鼠大負荷運動后即刻、時的血清、指標升高程度比較來看，組升高程度明顯要低，表明運動預處理對大負荷運動引起的心肌損傷具有一定的保護作用。運動預處理提高的心肌活性與大負荷運動引起的心肌損傷保護正常情況下，體內自由基水平取決于自由基生成與清除之間的動態平衡。清除自由基的酶促防御系統包括超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等，能有效清除體內活性氧并終止自由基鏈式反應過程。的主要功能是催化超氧陰離子

20、的歧化反應，而超氧陰離子是體內活性氧生成過程中初始產物。因此，被看作是活性氧防御的第一線屏障。丙二醛（）是活性氧終極代謝產物，也是衡量自由基水平的敏感指標。機體組織中活性下降可導致自由基生成增多，過氧化反應加劇及其產物含量增加。國內、外有關研究表明，運動性心肌損傷與活性下降、自由基水平升高有關，。自由基具有極其活潑的化學性質，能與各種細胞成份（膜磷脂、蛋白質、核酸）發生反應，使心肌細胞發生致命性損傷，。自由基損傷生物膜，使膜的結構、流動性及通透性發生改變，致使細胞膜上酶（包括其他蛋白）的功能出現障礙。氧自由基和脂質過氧化物可攻擊蛋白質，引起蛋白質分子聚合與肽鏈斷裂、蛋白質變性和功能喪失及酶失活

21、。研究發現，大鼠大負荷運動也引起了心肌細胞膜、活性下降。本實驗結果與其相一致。細胞膜通透性改變可使膜對的通透性增高，順濃度梯度流入增多；細胞膜活性下降通過交換機制使得大量進入細胞內，；細胞膜活性下降，不能有效地將細胞漿內多余的鈣離子泵出細胞外。最終，細胞內濃度升高。濃度升高使和鈣調蛋白結合增多，由此激活多種鈣依賴性降解酶，如磷脂酶、蛋白水解酶、核酸內切酶等，引起生物膜、細胞骨架和核酸分解，導致細胞壞死。鈣依賴性降解酶（蛋白水解酶）激活可降解心肌收縮蛋白，發生修飾，包括蛋白分解與降解、與其他肌鈣蛋白的交叉連接等，。大負荷運動引起的心肌升高與鈣超載有關。此外，自由基通過直接損傷線粒體及參與形成鈣超

22、載而損傷線粒體，致使線粒體合成的能力下降，生成不足。缺乏可通過參與鈣超載形成而損傷心肌：缺乏使不同階段心臟依賴能量的隔室化機制反應降低，使內流增加，細胞漿內增多激活膜磷酶，使膜磷脂降解為溶血磷脂，導致缺血性肌攣縮，并在此過程中產生自由基，進一步產生損害作用；缺乏引起的心肌細胞膜、活性下降加重了細胞內鈣超載，損傷心肌。最近有觀點認為，能量代謝障礙可造成心肌細胞基因結構及表達的異常，細胞內的水平是決定細胞發生凋亡或壞死的主要因素。綜上所述，自由基對心肌的危害主要體現在三方面：一是，直接損傷心肌細胞各種成份；二是，參與形成鈣超載而損傷心肌；三是，導致合成障礙。本實驗結果顯示，大負荷運動后即刻大鼠心肌

23、就已損傷，此時心肌活性明顯下降及含量明顯升高、濃度明顯升高、含量明顯下降，心肌細胞膜、活性明顯下降；運動后時心肌損傷較運動后即刻加重，此時心肌活性及含量、濃度的異常變化又較運動后即刻進一步加劇，含量有所恢復但仍處于較低水平，心肌細胞膜、活性也進一步下降；運動后心肌損傷已有明顯恢復，此時心肌活性與含量、濃度及心肌細胞膜、活性的異常變化均有不同程度恢復，含量也進一步得到恢復。根據本實驗結果，結合心肌缺血再灌注損傷的病理生理學研究觀點，可以認為：自由基、水平升高及缺乏在大負荷運動引起的心肌損傷中起到重要作用，而在運動后最初一段時間內主要是由于自由基、水平進一步升高而加重了心肌損傷；抗氧化酶活性下降是導致自由基水平升高的重要原因；自由基的損傷作用