1、銅綠假單胞菌檢查1簡述銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）,習稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣中，人和動物的皮膚、腸道、 呼吸道均有存在，故可通過環境和生產的各個環節污染藥品，本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中長引起 繼發感染，由于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度。國內外藥典均將銅綠假單胞菌列為檢查項目之一。銅綠假單胞菌按增菌，分離、純培養、革蘭染色、鏡檢及生化試驗等步驟進行檢驗。2儀器、設備和用具（見大腸埃希菌 2）。3試液、指示液3.1 0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液附錄3.1，3.3。3.

2、2 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液附錄3.2。3.3 1%鹽酸二甲基對苯二胺試液附錄2.1。3.4鹽酸試液附錄2.12。3.5氯仿附錄1.57。4培養基4.1營養肉湯培養基附錄5.1。4.2膽鹽乳糖（BL）培養基附錄5.6。4.3營養瓊脂培養基附錄5.2。4.4溴代十六烷基三甲胺附錄5.14。4.5綠膿菌素測定用培養基（POP瓊脂）附錄5.26。4.6明膠培養基附錄3.27。4.7硝酸鹽胨水培養基附錄5.28。5對照用菌液銅綠假單胞菌CMCC（B）10104營養瓊脂斜面培養物少許，接種至5ml營養肉湯培養基內，于36士 1C培養1824h后，用0.9%無菌氯 化鈉溶液稀釋至1:106，使對

3、照菌加入量含10100cfu （般用量為 0.1ml）,菌數測定在做陽性對照實驗用營養瓊脂澆碟或平板涂布經培 養后計數確定。6操作方法6.1供試品的取樣量（見細菌、霉菌和酵母菌計數5.3 ）。6.2供試液的制備（見細菌、霉菌和酵母菌計數7）;（大腸埃希菌6.2 ）。6.3增菌培養取膽鹽乳糖培養基2份，每份100ml, 1份加入1:10供試液10ml （相 當于供試品1g或1ml）。另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對 照。于36C 士 1C培養1824h （必要時可延至48h）。陰性對照菌應 無軍生長。6.4分離培養輕輕搖動上述增菌培養液，以接種環取 12環培養液（如有菌膜應 挑取之），劃線

4、接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于 36C 士 1C 培養1824h。銅綠假單胞菌在該培養基平板上的典型菌落為扁平、 圓形或無定形、邊緣不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴散現象， 在菌落相鄰處常有融合現象。菌落周圍常有水溶性藍綠色素擴散，使 培養基顯藍綠色，但亦有不產色素的菌株。菌落還有粗糙型和粘液型 等，應注意挑選。6.5純培養供試品分離平板生長6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時，以接種針輕 輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養物，應挑取23個疑似菌落， 分別接種營養瓊脂斜面，培養，作以下檢查。6.6革蘭染色鏡檢革蘭染色(見大腸埃希菌7.5 )。鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個，

5、成對或成短鏈排列。6.7生化試驗用銅綠假單胞菌CMCC(B) 10104做生化試驗的陽性對照株。氧化酶試驗取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內，以無菌玻璃棒挑取營養瓊脂斜面 培養物少許，涂在濾紙上，隨即滴加 1滴新配制的1%1鹽酸二甲基 對苯二胺試液，在30s內，紙片上的培養物出現粉紅色，逐漸變為紫 紅色，即為氧化酶試驗陽性反應。若培養物不變色或僅顯粉色為陰性 反應。本試驗應致意：(1) 試驗菌落(苔)必須新鮮，陳舊培養物反映不可靠。（2）試驗避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針（環）（白金 材料除外）挑取菌落（苔），否則易出現假陽性。宜用玻璃棒或木棒。（3）試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲

6、基對苯而胺氧化變色 不可用。（4）反應需在有氧條件下進行，勿滴加試劑過多，以免浸沒培養物， 使之與空氣隔絕，造成假陰性范性。（5）麥康凱、SS瓊脂培養基等含糖培養基上的菌落，不適于做氧化 酶試驗。因為糖分解產酸，抑制氧化酶活性。綠膿菌素試驗取營養瓊脂斜面培養物接種于綠膿菌素測定用培養基（PDP斜面上,36C 士 1C培養24h后，觀察斜面有無色素，如有色素，在試管內加 氯仿3 5ml，以無菌玻棒攪碎培養基并充分振搖。使培養物中的色 素完全萃取在氯仿液內。靜置片刻，待氯仿分層，用吸管將氯仿移至 另一試管中，加入鹽酸試液（1mol/L ）約1ml,振搖后靜置片刻，如 在鹽酸液層內出現粉紅色，即為陽

7、性反應，無粉紅色出現為陰性反應。 本試驗可用未接種的PDF瓊脂培養基斜面作陰性對照，陰性對照試驗 應呈陰性。如培養基斜面無色素產生，應于室溫培養12天再按上法試驗。凡經再次檢驗，綠膿菌素試驗仍為陰性者應繼續以下試驗。 硝酸鹽還原產氣試驗以接種環沾取少許營養瓊脂斜面培養物接種于硝酸鹽胨水培養基中， 置36C 士 1C培養24h，觀察結果。如在培養基內的小倒管中有氣體 產生，即為陽性反應，表明該培養物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產生氮氣。小倒管內無氣泡者為陰性反應。6.7.4 42 C生長試驗以接種環沾取少許營養瓊脂斜面培養物于0.9%無菌氯化鈉液中，制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養瓊脂斜

8、面上，立即置42 C士 1 C的恒溫水浴箱內，務使整個斜面浸沒在水浴中，培養2448h，斜面如有菌苔生長者為陽性反應；無菌苔生長為陰性反應。明膠液化試驗以接種針沾取營養瓊脂斜面培養物少許，穿刺接種于明膠培養基中，穿刺深度應接近培養基的底部，于36C 士 1 C培養24h。取出放入04C冰箱內1030mi n。如培養基呈溶液狀，即為明膠液化試驗陽性 反應；如明膠呈凝固狀，為陰性反應。本試驗應注意：(1) 本試驗接種前，培養基應為固態，否則需將培養基置冰箱內使 之凝固后，再穿刺接種。(2) 試驗應同時設未接種細菌的陰性對照管，與試驗管同時培養并 觀察結果。7結果報告7.1供試品培養物經證實為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.2供試品培養物氧化酶試驗陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養物，綠膿菌素試驗陰性時，其硝酸鹽還原產氣試驗、42C生長試驗及明膠 液化試驗皆為陽性時，亦報告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.3凡與7.1與7.2結果不符合報告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌。8注意事項8.1污染銅綠假單胞菌的藥物，因生產工藝和藥物的影響，在溴代十 六烷基三甲胺平板上的菌落形態可產生非典型形態。為防止漏檢，在 挑取疑似菌落時，宜取23個以上菌落，分