1、HIV-1病毒載量測定及質量保證指南（2013版）GuidelineforHIV-1ViralLoadTestingandQualityAssurance中國疾病預防控制中心2013年1月-JLA-1-4.刖B隨著HIV-1病毒載量檢測在艾滋病臨床輔助診斷、抗病毒治療監測及相關科研工作中的廣泛應用，我國開展該項檢測工作的實驗室日益增多。自1997年艾滋病實驗室首次引進HIV-1病毒載量檢測技術以來，截至2012年底全國已經配備115臺HIV-1病毒載量檢測儀，覆蓋疾控、醫院、檢疫、軍隊等系統，艾滋病流行重點地區及少數縣級實驗室均已配備HIV-1病毒載量檢測儀，每年檢測量已達13萬人份以上。由于

2、HIV-1病毒載量檢測質量對艾滋病的早期診斷及治療有重要影響，因此急需加強該領域的培訓和質量控制，規范實驗室操作，以保證檢測結果的準確性和可靠性。自2008年開始實施HIV-1病毒載量測定及質量保證指南（試行，以下簡稱指南）以來，參與HIV-1病毒載量能力驗證工作的實驗室從2007年的29家增加到2012年的107家，占已開展工作實驗室的百分之九十以上。通過綜合分析近幾年能力驗證發現的問題與檢測技術發展的實際情況，考慮各種試劑的檢測要求，結合專家意見和一線實驗室工作人員的經驗與需求，對本指南進行了適當修改、調整和補充，主要修改內容包括：（1）增加“人員要求”章節；（2）修改“常用HIV-1病毒

3、載量檢測方法”；（3）修改“HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）”；（4）補充常見問題分析和處理等內容。修訂后的指南共分八章，包括：總則，人員要求，實驗室環境與設施，樣品的采集、處理保存運輸，常用檢測方法簡介，室內質量控制，實驗室檢測能力驗證（PT）,實驗室生物安全，以及四個附表。本指南在修改過程中，接納了國內專家、同行的意見和建議，經過多次修改編寫成指南（2013）版。本指南由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心艾滋病參比實驗室組織有關專家撰寫，由中國疾病預防控制中心批準執行，并在HIV-1病毒載量檢測實驗室網絡內發布實施。由于國內各實驗室條件不同，不能采納所有實驗室的建議，因此本指

4、南主要提出一些原則上的參考建議，其中定有不妥之處，希望廣大同仁提出意見，以便不斷完善。本指南在2008年頒布的指南（試行）的基礎上修訂，在此對編寫試行版過程中給予幫助的國際組織和專家表示感謝。對本次修訂過程中提出建議的全國HIV-1病毒載量檢測實驗室基層工作人員表示衷心的感謝。本指南的解釋權屬于中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心。本指南編寫主持人：蔣巖本指南編寫人員：潘品良蔣巖李敬云鐘平尚紅李太生李繁本指南審核咨詢專家及技術人員：邵一鳴汪寧王佑春郭志宏肖瑤邱茂鋒邢文革姚均朱紅秦光明徐建青本指南編寫聯系人：潘品良本指南適用于全國HIV-1病毒載量檢測實驗室本指南編寫單位：中國疾病預防控制

5、中心性病艾滋病預防控制中心本指南自發布之日實施，同時終止2008年頒布的HIV-1病毒載量測定及質量保證指南（試行）。HIV-1病毒載量測定及質量保證指南目錄第一章總則第二章人員要求第三章實驗室環境與設施第四章樣品的采集、處理、保存、運輸第五章常用檢測方法簡介第六章室內質量控制第七章實驗室檢測能力驗證（PT）第八章實驗室生物安全附表1常見問題分析和處理附表2HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單附表3HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單附表4HIV-1病毒載量檢測報告單參考文獻縮略語第一章總則1.1 意義HIV-1病毒載量是指每毫升血漿中病毒顆粒的數量，是艾滋病防治工作中一項重要的實驗

6、室檢測指標。HIV-1病毒載量檢測主要用于抗病毒治療監測，包括治療時機判定、治療效果評估、耐藥預警；還可用于HIV感染的輔助診斷，包括窗口期、病程晚期、嬰兒感染、疑難樣本等的診斷；也可用于血液篩查。為了保證檢測結果的準確性和可靠性，必須對開展HIV-1病毒載量檢測的實驗室進行規范化管理和質量控制。1.2 目的指導HIV-1病毒載量檢測工作，規范實驗室質量控制與管理。L3適用范圍適用于我國開展HIV-1病毒載量檢測工作的所有實驗室。第二章人員要求HIV-1病毒載量檢測人員分為檢驗人、復核人、簽發人。1.1 培訓實驗室在使用新方法前，須對技術人員進行上崗培訓，獲得資格后方可開展相應工作。上崗培訓內

7、容至少應包括：HIV檢測相關基礎知識，HIV-1病毒載量檢測技術及管理要求，實驗操作，質量保證與質量控制，生物安全。2. 2檢驗人進行HIV-1病毒載量檢測的人員須具有艾滋病檢測實驗室的上崗資格，接受過省級以上的實驗操作技術及艾滋病實驗室生物安全培訓及廠家的技術操作培訓。所有相關檢驗人員需經公司工程師操作培訓，能獨立熟練地操作，并經考核合格，持證上崗。2.3復核人、簽發人應具備對檢測過程進行分析、解決問題的能力。復核人負責對原始數據查閱、結果核對，簽發人核實結果正確后對外簽發報告。第三章實驗室環境與設施除了HIV-1病毒載量檢測儀器，合理地、充分地配備實驗室環境、設施、輔助設備是保證HIV-1

8、病毒載量檢測質量的重要方面。3.1實驗室環境HIV-1病毒載量實驗室應符合分子生物學實驗室基本要求，包括試劑準備區、樣品處理區、擴增產物分析區。實驗室設置總體原則為各區獨立、控制風向、因地制宜、方便工作。具體要求：3. 1.1各區必須是相互獨立的，有條件各區內可分別設置緩沖間，以保證不同區之間完全分隔開。3. 1.2各區的儀器設備與各種物品必須為專用，避免交叉污染。3. 1.3試劑準備區和樣品處理區內須保持低度正壓（或常壓）狀態，使空氣流向始終由室內向外，以避免擴增污染物進入此區域。3. 1.4擴增產物分析區內須保持低度負壓狀態，使空氣流向始終由室外向內，以防止擴增產物通過氣溶膠流出，造成與其

9、他區域的交叉污染。實驗室可安裝排風扇或其他排風裝置。3.1. 5擴增產物分析區可以設在遠離其他各區的地方。3. 1.6工作時必須遵循單一工作流向，即只能從試劑準備區開始，到樣品處理區，然后到擴增產物分析區。3. 2實驗室設施各種HIV-1病毒載量檢測方法除病毒載量檢測儀外，還需要配備相應的輔助設備才能完成檢測。HIV-1病毒載量檢測實驗室設備分布示意圖提供為HIV-1病毒載量檢測實驗室不同區內必備的輔助設備及耗材。輔助設備應根據不同檢測方法作相應變化。3. 2.1樣品處理區：生物安全柜：二級離心機（32000g,適合1.5mL離心管）冰箱：2-8,-20,-70以下水浴箱：誤差范圍小于0.5加

10、樣器1套（20uL、200uL.1000uL）帶濾芯的一次性吸頭（無DNA和RNA酶），1.5mL離心管（無DNA和RNA酶）及相應試管架計時器旋渦振蕩器：震動頻率可調一次性工作服、帽、口罩、無粉手套和鞋套HIV-1病毒載量檢測實驗室設備分布示意圖病毒載量儀生物安全柜超凈工作臺漩渦振蕩器漩渦振 蕩器冰箱2-8°r實驗臺 冰箱一20冰箱2-V擴增產物分析區樣品處理試劑準備區區3.2.2試劑準備區：超凈工作臺（或密閉工作臺）加樣器1套（20uL、200uL、1000nL）離心機（18000g,適合1.5mL離心管）冰箱：2-8,-20計時器旋渦振蕩器，震動頻率可調帶濾芯的一次性吸頭（無D

11、NA、RNA酶）L5mL離心管（無DNA和RNA酶）及相應試管架一次性工作服、帽、口罩、無粉手套、鞋套3. 2.3擴增產物分析區：HIV-1病毒載量檢測儀加樣器1套(20uL、200uL.1000HL)冰箱：2-8,-20旋渦振蕩器，震動頻率可調一次性工作服、帽、口罩、無粉手套和鞋套帶濾芯的一次性吸頭(無DNA、RNA酶)第四章樣品的采集、處理、保存和運輸樣品的采集、處理、保存和運輸要求保證滿足不同HIV-1病毒載量檢測方法對樣品性質的，并保證生物安全。因此需按照所使用檢測方法的要求嚴格執行抗凝、分樣時間、運輸包裝、保存溫度、凍融記錄。用于HIV-1病毒載量檢測的樣品須采用抗凝血漿。4.1樣品

12、的采集4. 1.1采樣器材：一次性抗凝真空采血管、持針器、蝶形針等。4. L2抗凝劑：通常采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸椽酸鈉），須符合不同檢測方法對樣品的要求。4.1. 3樣品標識：在采血管上貼唯一性樣品編號。4.1.4樣品采集量：通常采集全血8-10ml,采集的樣品量應與定量采血管的刻度要求一致，避免血液凝固或稀釋。4.L5樣品混勻：采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管10次，使血液與抗凝劑充分混勻。4. L6其它信息：HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）的備注欄內需注明采集對象的基本信息和流行病學資料、抗病毒藥物使用情況、最近一次的實驗室病毒載量檢測結果。4.2 樣品

13、的處理1. 2.1要求在采血后6小時內離心樣品，室溫下使用離心力為800-1200g（1500-3000rpm）離心10分鐘后，吸出血漿，分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中，并注明分裝時間，凍存管應提前貼上耐凍的樣品編號標簽。4. 2.2血漿樣品不能滅活。5. 2.3做好樣品處理記錄，包括冰箱溫度變化、樣品存取。4.3 樣品的保存4.3. 1保存條件：根據血漿檢測時間而定，4天內可在4暫時保存，3個月內應凍存于-20以下，3個月以上應置于-70以下。不能使用自動除霜冰箱。4.3.2血漿樣品凍融不應超過3次。4.3.3監控并記錄保存溫度以及樣品狀態的變化4.3.4防止樣品變質、泄漏及污染。4.4樣品

14、的運輸根據可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規定的要求運輸，并嚴格控制運輸的冷凍狀態，避免樣品融化。4.5樣品的發送和接收4.5.1發送樣品時，需詳細填寫樣品HIV-1病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）。4.5.2接收樣品時，按HIVT病毒載量檢測樣品送檢及接收單（附表2）核對樣品數量，檢查樣品狀況。4.5.3樣品管破損造成樣品溢出、出現明顯溶血、凝血的樣品，不宜作HIV-1病毒載量檢測；如果樣品已經融化，可以4c保存并盡快檢測，記錄凍融一次。第五章常用檢測方法簡介HIV-1病毒載量檢測根據方法的原理不同，分為不同系列儀器，目前常用的HIV病毒載量的測定方法有：核酸序列

15、依賴性擴增(NASBA)技術,代表產品為實時熒光技術NucliSensEasyQ儀；分枝DNA信號放大系統(bDNA)技術，代表產品為bDNA440分析儀；實時熒光定量PCR擴增技術(real-timePCR),包括CobasAmplicorTaqman檢測系統、M2000檢測儀與國產試劑盒均屬此類技術。5.1核酸序列依賴性擴增(NASBA)技術最早產品為NucliSensECL定量RNA測定方法，已經被NucliSensEasyQ新一代實時分子信標定量擴增所取代。所采用的NASBA技術是一種等溫擴增系統，其擴增基礎在于系統內的混合酶系統，此系統內含有逆轉錄酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶在

16、體外模擬逆轉錄病毒體內復制過程。NuclisensEasyQ結合NASBA技術、BOOM核酸提純技術與分子信標探針技術(MolecularBeacon)檢測血漿中的HIVRNA水平。這種結合方法使用實時擴增分析(real-timeamplificationassay),提高對診斷質量的要求。此方法可分為三個步驟：核酸提取、擴增和等溫檢測。NucliSensEasyQHIV-1的檢測是利用靶特異的分子信標進行，分子信標的DNA寡核甘酸片段包含一段可特異結合靶RNA的序列。當RNA互補鏈不存在時，分子信標維持內部發夾結構，使猝滅基團處于非常接近熒光素的位置，熒光信號被猝滅。當分子信標與互補靶序列結

17、合，發夾打開釋放熒光信號，報告靶序列的存在。NucliSensEasyQHIV-1使用兩個不同的分子信標，一個是針對野毒株HIV-1RNA的擴增子，另一個針對內標物RNA(calibrator)的擴增子，各使用不同熒光染料(野毒株使用6-FAM,內標物使用6-R0X),從而實現靶序列和內標物RNA兩個擴增過程的各自跟蹤。熒光信號的動力學分析可以顯示野毒株和內標物RNA的轉錄速率，因此可以計算出原樣本中HIV-1RNA含量。5.2分枝DNA(bDNA)技術分枝DNA測定技術基于其獨特的信號放大系統，即分枝DNA信號放大系統，為一個人工合成的分枝DNA,分枝DNA的分枝可結合多個酶標記物，從而將病

18、毒的信號放大，以便進行檢測。此檢測系統不涉及核酸擴增反應。方法定量系統中沒有內標記物，每次實驗設置一系列外部標記，通過實驗樣品反應強度與外部標記樣品強度的比較確定待檢樣品的病毒拷貝數。bDNA檢測通常包括以下步驟：（1）將患者血清或血漿連同含有特異的合成寡聚核甘酸靶探針的裂解液加到微孔中；（2）孵育，釋放病毒核酸，降解RNA酶或使DNA變性，然后靶探針結合到靶RNA或DNA并固定在固相板上；（3）冷卻洗板；（4）加信號放大探針（bDNA）到各孔內；（5）孵育，使bDNA雜交到靶探針的相應部位；（6）冷卻洗板；（7）加標記探針到各孔內；（8）孵育，使酶標記的探針雜交到bDNA上；（9）冷卻洗板；

19、（10）加化學發光底物到各孔中；（11）孵育，酶和底物相互作用，產生化學發光信號。發射的光強以相對光量值（RLUs）表示。產生的光強直接與各樣品中病毒RNA或DNA的拷貝數成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一同處理的標準所制作的標準曲線計算獲得。bDNA440病毒載量檢測儀較bDNA340在孵育、沖洗和加樣步驟由手動操作轉變為自動化，減少污染，更便于操作節省實驗時間。5. 3實時（real-time）熒光定量PCR擴增實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應管內的熒光信號到達設

20、定的域值時所經歷的循環數Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備，抽提和濃縮目標RNA分子，并除去可能存在的抑制因子。（2）Real-timePCR,檢測PCR的產物使用熒光標記的寡核甘酸探針。檢測的原理基于熒光信號增長曲線與循環數相關。（3）RT-PCR反應，病毒RNA利用逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA,然后通過DNA聚合酶對特定片段進行擴增。（4）擴增產物的檢

21、測，基于檢測閾值的設定，當病毒載量高時，低循環數即能檢測到熒光信號，當病毒載量低時，高循環數時才能檢測到熒光。循環數與樣品病毒載量成線性關系。利用標準品制作循環數與病毒載量的標準曲線就能對樣品病毒載量進行定量檢測。目前此原理已為多種HIVT病毒載量檢測的的主要方法，包括CobasAmplicorTaqman檢測系統、M2000檢測儀和國內產品凱杰、達安以及正研制的定量檢測試劑均屬于該技術。CobasAmplicorTaqman檢測系統是全自動化的實時熒光定量PCR病毒載量平臺，具有樣品進一結果出(sample-in,result-out)的特點。此方法的檢測過程為：裝待測樣品、放試劑和耗材、核

22、酸提取、PCR反應體系制備、實時熒光定量PCRoTaqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎，Taqman熒光探針為一寡核昔酸，兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步，從而實現定量。M2000利用RT-PCR法，在開始制備樣本時，對每個樣本加入與HIV-1目標序列無關的RNA序列。這種不相關的RNA

23、序列通過RT-PCR被同時擴增，從而充當內部質控品(IC)o在m2000rt儀器上，每個擴增循環中存在的HIV-1目標序列總量通過含熒光標記的寡核甘酸探針測定。m2000rt系統通過樣品制備、試劑制備和反應板裝置、擴增、檢測四個步驟，檢測到熒光信號的擴增循環與初始樣本中存在的HIV-1RNA濃度對數成比例。國內產品匹基、達安試劑盒的原理步驟與上述類似，為開放式試劑，可以使用多款實時熒光定量PCR檢測儀。6. 4不同方法檢測結果間相互關系病毒載量的檢測單位有拷貝數(CP)/ml和國際單位(IU)/ml,且同一樣本不同方法的病毒載量檢測結果不同，另外，不同方法間檢測結果并無固定的轉換關系，與病毒亞

24、型、試劑不同版本有關，因此評估同一病人的治療效果需用同一種方法檢測，并且考慮試劑版本的更新情況。第六章室內質量控制內部質量控制是在良好實驗室整體環境支持下，從樣品接收到發出報告整個過程每個環節的管理過程，包括：（1）人員；（2）實驗室分區和環境；（3）儀器；（4）檢測過程（試劑、操作過程、質控品使用）；（5）數據報告。7. 1人員HIV-1病毒載量檢測人員分為檢驗人、復核人、簽發人。7.1.1 所有相關檢驗人員需經操作培訓，能獨立熟練地操作，并經考核合格，持證上崗。7.1.2 復核人、簽發人應具備對檢測過程進行分析、解決問題的能力。6. 2實驗室分區和環境6. 2.1實驗室分區的功能HIV-1

25、病毒載量檢測實驗室原則上應分為三個獨立工作區：試劑準備區、樣品處理區、擴增產物分析區，并設在不同房間。不同檢測方法的分區功能和要求可有所不同。6.2. 1.1試劑準備區：擴增試劑的配制、分裝和保存；6.3. 1.2樣品處理區：樣品登記、分裝，核酸提取、保存和加樣；6.4. 1.3擴增產物分析區：產物擴增的測定、結果分析、登記及報告。嚴格要求三區的單一空氣流向：從試劑準備區到樣品處理區，然后到擴增產物分析區，不能逆向流動。實驗室的設置及輔助設備的具體要求參見第立二早。6.2.2實驗室環境的要求6.2.2.1實驗室有足夠的空間；6.2.2.2采光好，應避免陽光直射設備；6.2.2.3室溫控制在18

26、25；6.22.4室內相對濕度控制在3070%；6.2.2.5電源穩定，HIV-1病毒載量檢測儀應配備穩壓電源；6.2.2.6室內保持干凈整潔，無灰塵；6.2.2.7實驗前后，用75%乙醇或0.1%次氯酸鈉及時處理操作臺面。6. 3儀器設備質控1. 3.1加樣器、溫濕度計須經計量部門校準，每年一次，每半年期間核查一次。6. 3.2HIV-1病毒載量檢測儀及其配套儀器可以委托公司校準，每年一次。7. 3.3離心機可以委托計量部門或公司校準，每年一次。8. 3.4冰箱、水浴箱用校準合格的溫度計測量溫度，每次做好記錄。6.4檢測過程質控6.4.1試劑質控6.4.1.1使用經國家食品藥品監督管理局注冊

27、的試劑。6.4.1.2所有試劑盒須嚴格按要求條件保存。6. 4.1.3試劑盒拆封時，要記錄拆封時間，所有試劑嚴格控制在有效期內使用。6.4. 2實驗用水：要求使用無DNA和RNA酶的去離子水。6.4.3操作過程質控按照試劑盒要求與實驗室的條件及時更新標準操作程序（SOP）,并嚴格執行，不得擅自修改。6.4.4質控品的使用每次實驗按照試劑盒說明書的要求使用試劑盒提供的質控品，并滿足質控要求。同時使用外部質控品（HIV病毒載量值為5000-15000拷貝/毫升質控品），如果試劑盒沒有陰性質控品，需加一個陰性質控品。6. 4.4.1外部質控品的制備、定值及使用（1）制備對用于制備質控品的大樣本血漿樣

28、品，要求用EDTA抗凝劑抗凝，新鮮抗凝血離心分離，得到透亮血漿。然后用孔徑為0.2微米的濾膜過濾除菌，充分混勻。按各自方法對樣品量的需求，用無菌凍存管定量分裝，標記，封口，凍存于-70以下非自動除霜冰箱內，避免反復凍融。按實際使用量的要求配制足夠量外部質控品（推薦每次配置量可使用兩年）。(2)定值從制備好的外部質控品中隨機選出5管，嚴格按照實驗室的各自方法標準操作程序進行HIV-1病毒載量檢測，將測得結果的拷貝值或IU值換算成LoglO值，計算其算術平均值(M)和標準偏差(S)o(3)質控圖的繪制和使用根據測得值，在坐標圖上畫出平均值、土2S、±3S線圖，作質控圖使用。每次檢測都應帶

29、一個外部對照，將得到的外部質控品LoglO值標在上述質控圖上。每次質控品測得值在平均值土2.0s內方為有效。使用新批次的外部對照質控品時，必須重新繪制質控圖。(4)質控品不宜使用稀釋方法制備。6.5數據分析、結果報告6. 5.1在試劑盒及外部質控品結果滿足要求的前提下，對樣品進行分析。7. 5.2外部質控品不合格，樣品需要重新檢測。8. 5.3結果超過檢測上限的樣品應稀釋以后重新檢測。9. 5.4復核人對檢測結果進行仔細復核并對結果提出結論、簽字。10. 5.5簽發人對結果的結論進行審核、分析、總結、簽字。11. 5.6按不同方法的要求，以拷貝/毫升或國際單位/毫升為單位報告樣品的HIV-1病

30、毒載量值。第七章實驗室檢測能力驗證（PT）HIV-1病毒載量檢測的外部質量控制可以通過參加外部質量評價，提高實驗結果的可比性，發現系統誤差，改進實驗室工作，提高檢測質量。HIV-1病毒載量檢測實驗室須參加艾滋病/丙肝參比實驗室或有資質的國內外機構組織的HIV-1病毒載量檢測能力驗證來實施外部質量控制。12. 1PT組織艾滋病/丙肝參比實驗室為HIV-1病毒載量檢測能力驗證（PT）的組織者，負責制定國內HIV-1病毒載量檢測能力驗證的計劃并組織實施。國內所有從事HIV-1病毒載量檢測的實驗室須參加該PT項目，在規定時間內使用有效試劑與實驗樣品一起檢測，填寫HIV-1病毒載量檢測報告單（附表4）,

31、上報艾滋病/丙肝參比實驗室。鼓勵有條件的實驗室參加有資質的國內外機構組織的PT活動。7. 2PT實施7.1.1 PT樣品組成：每次5份。包括陰性、不同拷貝數的陽性樣品。可以根據實驗室的考核目的制備考核盤。12.1.1 2.2PT頻率：一年2次。14.2.3 PT樣品的接收與保存：要求參加PT的實驗室收到考核樣品后，立即進行核對、檢查，填寫HIV-1病毒載量檢測能力驗證樣品接收專用單（附表3）,3天內傳回艾滋病/丙肝參比實驗室。如發現考核樣品缺失、量不足、空管等情況，及時書面回報，艾滋病/丙肝參比實驗室負責補寄或更換。收到樣品后應及時檢測或在-70度以下保存。14.2.4 PT樣品的檢測：要求將

32、考核樣品同實驗室常規樣品一起檢測，由常規檢測人員進行。14.2.5 PT結果的報告和處理：參加PT的實驗室必須在規定的時間內，用電子郵件或書面報告實驗結果，并將HIV-1病毒載量實驗結果報告單和打印的儀器原始記錄一起上報給艾滋病/丙肝參比實驗室，艾滋病/丙肝參比實驗室將負責結果錄入和處理。有任何原因不能按時上報者，需有單位蓋章的書面申請。7. 2.6評分原則將參與實驗室反饋結果換算成對數值（Lg）,再按同一種方法與同一個考核品的的所有實驗室結果進行統計，算出平均值（M）和標準偏差（S）O7. 2.6.1成績判定：根據每個參與考核實驗室一年兩次所有考核品的結果進行綜合評分（每一個考核品的評判標準

33、依照7.2.6.2與7.2.6.3條款），判定標準為：優秀：所有考核品沒有問題；良好：有一個考核品滿足7.2.6.2中的條款；合格：兩個考核品滿足7.2.6.2中的條款不合格：至少有三個考核品滿足7.2.6.2中的條款或至少一個考核品出現7.2.6.3中的條款。8. 2.6.2樣品結果在M+2.OSM+3.OS內；樣品結果在M-2.OSM-3.OS內；考核結果報告沒及時上報；沒按要求上報原始記錄。9. 2.6.3樣品結果超過M+3.OS；樣品結果M-3.OS；假陽性；假陰性；無效結果。7. 2.7評估結果反饋：艾滋病/丙肝參比實驗室根據各實驗室的兩次考核結果，及時反饋每次評估結果。每年反饋最后

34、的評估結果，并發證書。8. 2.8抱怨和申訴：參評實驗室如對評估結果或其它方面存有異議，可以在收到結果后10天內向艾滋病/丙肝參比實驗室提出異議，后者在核實情況后予以答復。7.2.9現場督導：根據考核情況的需要，艾滋病/丙肝參比實驗室組成技術專家組對不合格實驗室進行現場檢查。檢查內容包括：實驗原始數據、實驗室布局、儀器運行狀況、輔助設備校準狀況、實驗耗材質量、樣品保存、試劑盒使用狀態、人員培訓狀況、質量保證和質量控制等。給實驗室反饋督導報告，現場實驗室按相關建議作出整頓。第八章實驗室生物安全8.1相關依據病原微生物實驗室生物安全管理條例、實驗室生物安全通用要求、可感染人類的高致病性病原微生物菌

35、（毒）種或樣品運輸管理規定、人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理辦法和全國艾滋病檢測技術規范。8. 2安全細則8.2. 1進入實驗室應穿工作服、戴口罩、戴一次性乳膠手套。嚴禁在實驗室內進食、飲水和吸煙以及使用化妝品。8. 2.2所有樣品包括試劑盒中的人源性成份（如陰、陽性對照）都應在生物安全柜內進行處理。8. 2.3樣品應盛裝在有螺旋蓋的離心管中，以防樣品濺出或產生交叉污染。當具有潛在傳染性的物質溢出時，立即用0.1%次氯酸鈉溶液或其它消毒劑處理污染區及器材；接觸過標本的耗材應置有專用消毒劑的容器，與一次性物品一起在丟棄前進行高壓滅菌處理。8. 2.4避免試劑盒中各種有

36、毒有害化學成分（如疊氮鈉、二甲基亞颯、異硫氧酸胭）對人體或環境可能造成的危害。8. 3生物安全培訓8.3. 1所有涉及HIV-1病毒載量檢測的人員都應經過嚴格的安全培訓，要掌握生物安全保障的原則、措施。每個人的安全教育均應記錄在實驗室和人事檔案中。8. 3.2省級及以上疾控中心艾滋病實驗室負責HIV/AIDS檢測生物安全培訓及HIV-1病毒載量檢測培訓。8. 3.3檢測相關人員應主動接受實驗室生物安全員以及安全負責人的監督。所有實驗室意外事件均應進行記錄和報告。8. 3.4所有人員要保護自身和環境的安全。8. 3.5參照實驗室安全指南和標準操作程序的有關規定執行具體操作。8. 4職業暴露處理8

37、. 4.1實驗室應建立完善的艾滋病職業暴露后的預防機制。9. 4.2發生職業暴露后，首先進行應急處理，然后根據暴露級別和暴露源頭嚴重程度，評估風險級別，并決定是否進行預防性用藥和用藥程序，如需要時，盡早開始服用抗病毒藥物。10. .3按規定進行職業暴露登記、檢測和報告，注意做好保密工作。附表1常見問題分析一）EasyQ問題（出現錯誤代碼）處理方法錯誤代碼1:未檢測到信標嚴格按標準操作步驟執行（如樣本裂解、酶溶解要充分）錯誤代碼2：內標數據與野生型數據不符由公司工程師解決軟件收集數據出錯誤代碼3：曲線中斷使用穩壓電壓錯誤代碼4：無擴增a、標本中有嚴重的溶血、脂血和纖維蛋白或一些未知的抑制因子，渾

38、濁標本，檢測前離心樣品2000g,56分鐘。b、充分裂解樣品。c、充分溶解內標。d、加硅膠后，立即震蕩混合。e、清洗過程中要洗干凈裂解液或洗液，管壁上有殘留的裂解液或洗液log、洗脫后立即將核酸和硅膠分離。（核酸又被硅膠吸附）h、轉移核酸時避免吸入硅膠。i、充分溶解引物，立即振蕩溶解。j、充分溶解酶。放置時間要大于15分鐘。復溶時需在室溫下進行。k、用準確的微量加樣器加入足量引物。1、排除排管底部的氣泡，排管放到孵育器上時需壓緊。以充分振蕩排管，完全混勻反應體系液體。n、密封保存排管、離心管等耗材。、控制環境中的抑制物污染。P、溫度需降至41c時即將酶溶液混入反應排管。錯誤代碼5：弱擴增曲線平

39、緩，操作時溫度控制穩定及混合充分錯誤代碼6：計算錯誤檢查電腦軟件錯誤代碼7：異常擴增正確加入核酸，保持電壓穩定，嚴格控制引入抑制物。錯誤代碼8：延遲時間過短加入酶后及時進行擴增，操作熟練。錯誤代碼9：弱擴增常見錯誤，詳見代碼4o應注意操作細節避免錯誤發生。錯誤代碼10：未檢測到內標加入內標，減少標本量或者稀釋樣再進行檢測。錯誤代碼11:信息不全操作時注意事項參考4和9中細節避免錯誤發生。錯誤代碼12：延遲時間過長導出結果，曲線截圖，公司工程師解決。二）bDNA問題處理方法注射器含有氣泡加適量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶內液面下。分析儀底部的加熱托盤上有液體檢查管路連接。管路有堵塞或細菌滋生

40、每次實驗后清洗并晾干洗液瓶和水瓶，倒空廢液瓶；每周清洗洗液瓶，水瓶和廢液瓶，管路系分析儀不能從孔內吸取足夠的液體檢查廢液管連接頭RLU值低確定按產品要求儲存、配制試劑；環境溫度在18-30；試劑盒沒有過期；實驗中所使用的試劑來自同一批次；每周清洗過程中在管道和試劑瓶中沒有殘留。RLU值高確定全使用干凈的一次性無菌實驗材料；使用防氣溶膠的加樣槍頭；殘留的底物沒有倒回原瓶；用70%乙醇定期擦洗微量加樣器；盛洗液的試劑瓶內有足夠量的洗液；檢查分液、吸液操作；每周進行保養；分析倉門關閉嚴實；檢查背景RLU變異系數（CV）高確定微量加樣器經校準；使用防氣溶膠的槍頭；槍頭緊密套在加樣器上；加試劑時槍頭位置

41、在孔的中部；樣品凝塊或殘渣沒有被吸取；樣品加的位置與樣品ID和DMS規定的位置一致；樣品按產品說明收集，處理和儲存；只使用干凈的一次性無菌實驗材料；檢查分液吸液操作；盛洗液的試劑瓶內已裝有足夠量的洗液；每種試劑在實驗開始前被輕輕混勻；每種試劑預熱充分，以防有沉淀；封閉墊組裝正確；孔內樣液沒有濺灑；分析倉門關閉嚴實；檢查RLU背景。標準曲線平坦或不正常加標準時板的缺口在左邊強或弱對照定量高確定各孔仔細加樣，未觸及鄰孔；使用無菌槍頭；封閉墊組裝無誤；加樣器定期校準；使用防氣溶膠的槍頭；標準和對照加樣位置正確；按產品說明要求儲存，配制。強或弱對照定量低確定試劑盒在運輸和到貨后儲存在正確的溫度；使用無

42、菌槍頭；沒有吸取氣泡；封閉墊組裝無誤；加樣器經校準；小心處理測試板，防止濺灑；標準照加樣位置正確；按產品說明要求儲存，配制；樣品，標準，對照在吸取前至少震蕩5秒。量過多WA背景光路值大于或等 于 0. 05 IRL實驗過程中一孔或者 幾個孔出現WA2435或 者WA2437報警，但儀 器沒有停機，出現報警 的孔沒有實驗結果。 儀器底部洗站周圍出 現水跡或者有明顯漏 水實驗過程中出現CL開 頭的錯誤代碼實驗完成后打開艙門， 發現試劑倉中部有明 顯積水打液不均勻排液殘余檢查抽洗軸頭是否堵塞，如果有堵塞，卸下后用注射器疏通。檢查用于進行背景檢查的白色間隔反應孔是否被污，檢查光路讀數頭是否有破損漏光現

43、象檢查實驗用水和次氯酸鈉是否達標，水是否有污染，管路是否有堵塞或者漏氣現象，反復清洗管路。檢查抽洗軸頭是否堵塞。檢查蠕動泵管是否有破裂或者安裝錯誤，檢查洗站和排液管連接是否有裂縫。檢查板架四角磁鐵是否有脫落現象，用AB膠粘好。查看房間濕度是否低于60%,開除濕機除濕。打開儀器艙門，在儀器艙內部放少量固體干燥劑三）Taqman問題處理方法設備出現未預料的資源錯誤重新啟動設備和AMPLILINK軟件AMPLILINK軟件出現數據庫錯誤重新啟動AMPLILINK軟件熱循環區域出現：TC溫度同步化；TC蓋同步化重新啟動設備條碼掃描機出現資源cmd為掃描機硬件錯誤，重新啟動設條碼閱讀機出現條碼不可讀條碼松則采取條碼復位；條碼損壞則重新載入或生成新的序列樣本量不準確樣本量不足0.970ml或超過1.030ml均不可檢測送檢單位送樣人送檢日期采樣時間采樣管抗凝劑運輸保溫方式姓名性別年齡現住址戶籍所在地是否治療是治療號：否樣品編號樣品性質樣品量(ml)備注接收單位接收人接收日期實