1、SDS-PAG窿白質(zhì)電泳常見問題分析日期：2012-05-25來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng)作者：青嵐點(diǎn)擊：2218次摘要：SDS-PAG電泳主要利用聚丙烯酰胺的分子篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)和核酸，SDS-PAG蛋白質(zhì)電泳分析可從蛋白質(zhì)亞基分子量的大小就分離蛋白質(zhì)。SDS上要利用的篩效應(yīng)分離蛋白質(zhì)和核酸，SDS-PAG!白質(zhì)電泳分析可從蛋白質(zhì)亞基量的大小就分離蛋白質(zhì)。幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所有條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并進(jìn)可能減少其相互間的聚集，最常用的就是電泳技術(shù)，關(guān)于大家在此過程中經(jīng)常遇到的問題進(jìn)行一些討論：Q:SDS-PAG電泳的基本原理？A:SDS聚丙烯酰胺，是在聚丙烯酰胺

2、凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS什二烷基硫酸鈉），SD8與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS勺量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS-肽復(fù)合物在內(nèi)稀酰胺中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW二K-bX式中：例/先吩子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。Q:配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？A:在SDS-P

3、AG不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是，分離膠；而電泳緩沖液使用的Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中PH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的

4、影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q：樣品如何處理？A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS&理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS&理。1、還原SDS#理：在上樣buffer中加入SDS?口DTT域Beta琉基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDStf蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer,離心，沸水煮5min,再離心加樣。2、帶有烷基化作用的還原SDS&理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；

5、另碘乙酸胺可捕集過量的DTT而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100屋樣品緩沖液中10履20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30mino3、非還原SDS&理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDSI水中煮3min,未加還原劑,因而蛋白折?未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來(lái)使用。Q：SDS-PAG電泳凝膠中各主要成分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇，分離膠選擇，選擇tris-HCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEME西AR促凝作用，力口速聚丙烯酰胺的凝固;十二烷基硫酸鈉（SDS）:陽(yáng)離子去污劑，作用有四：

6、去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折7Q：提高SDS-PAG也泳分辨率的途徑？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者2、易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS吉晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)P82-103oQ：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？A:主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其

7、充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？A:主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？A:主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長(zhǎng)，重新配制；降低凝膠濃度。Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？A:主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。Q：什么是“鬼帶，如何處理？A:“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣

8、孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來(lái)被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合,聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的學(xué)迥生，在WBE應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta琉基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量來(lái)阻止還原劑的氧化。Q:為什么澳酚藍(lán)不能起到指示作用？A:我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到澳酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來(lái)的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。Q：為什么電泳的條帶很粗？A:電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的pH正確；適當(dāng)降低電壓；Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？A:這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50V以上，可電流卻在5mAW下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）O處理辦法：電泳槽正確裝配即可。Q：濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？A:這主要