1、1單克隆抗體的制備及應用單克隆抗體的制備及應用西南大學西南大學 2XXXXXXXXXXXXXXXXXX 目目 錄錄1 1單克隆抗體的簡介單克隆抗體的簡介2 2單克隆抗體技術發(fā)展經歷單克隆抗體技術發(fā)展經歷3 3單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備4 4單克隆抗體的應用單克隆抗體的應用5 5 展望展望3單克隆抗體的簡介單克隆抗體的簡介1 第一部第一部分分 4XXXXXXXXXXXXXXXXXX單克隆抗體的簡介單克隆抗體的簡介19751975年分子生物學家年分子生物學家G.J.F.G.J.F.克勒和克勒和C.C.米爾斯坦在自然雜交米爾斯坦在自然雜交技術的基礎上，創(chuàng)建立雜交瘤技術。他們把可在體外培養(yǎng)技術的

2、基礎上，創(chuàng)建立雜交瘤技術。他們把可在體外培養(yǎng)和無限增殖的骨髓瘤細胞與經抗原免疫后的純系小鼠脾細和無限增殖的骨髓瘤細胞與經抗原免疫后的純系小鼠脾細胞融合，形成胞融合，形成B B細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞既具有瘤細胞細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞既具有瘤細胞易于在體外無限增殖的特性，又具有脾淋巴細胞那樣合成易于在體外無限增殖的特性，又具有脾淋巴細胞那樣合成和分泌特異性抗體的特點。和分泌特異性抗體的特點。這種雜交瘤，通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單這種雜交瘤，通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系，即雜交瘤細胞系，它所產生的抗體是針對同一抗克隆系，即雜交瘤細胞系，它所產生的抗體是針對同一抗原

3、決定簇的高度同質的抗體，即所謂單克隆抗體原決定簇的高度同質的抗體，即所謂單克隆抗體（ mAbs mAbs ），簡稱單抗。），簡稱單抗。5 單克隆抗體技術的發(fā)展經歷單克隆抗體技術的發(fā)展經歷2 第二部第二部分分 6 XXXXXXXXXXXXXXXXX鼠源性單克隆抗體嵌合性單克隆抗體人源化單克隆抗體全人源單克隆抗體鼠源性單克隆抗體是來源于鼠蛋白，因此對于人體而言是外來物從而易被抵抗。嵌合性單克隆抗體是指同時具有人和鼠的來源構成，通常是30%比70%。鼠源部分用來結合抗原，人源部分用來誘導產生療效。人源化抗體就是指抗體的可變區(qū)部分或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體

4、造成的免疫副反應。其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。 。單克隆抗體技術發(fā)展經歷單克隆抗體技術發(fā)展經歷7 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備3 第三部第三部分分 8XXXXXXXXXXXXXXXXXX單克隆抗的制備單克隆抗的制備動物免疫動物免疫11234細胞融合和選擇性培養(yǎng)細胞融合和選擇性培養(yǎng)雜交瘤細胞的篩選及克隆化雜交瘤細胞的篩選及克隆化大量制備及純化大量制備及純化 9XXXXXXXXXXXXXXXXXX單克隆抗體制備的簡易流程單克隆抗體制備的簡易流程 10XXXXXXXXXXXXXXXXXX動物免疫動物免疫抗原制備抗原制備：制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上：制備單克隆

5、抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，同時應根據所研究的抗原和免疫抗原是越純越好，同時應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，免疫用的抗原只實驗室的條件來決定。一般來說，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。抗原進行純化。 11XXXXXXX

6、XXXXXXXXXXX免 疫 動 物 的 選 擇免 疫 動 物 的 選 擇 ： 一 般 的 雜 交 瘤 生 產 都 選 用： 一 般 的 雜 交 瘤 生 產 都 選 用BALB/c小鼠或小鼠或LOU/c大鼠作為免疫動物。但是，大鼠作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。就小鼠而言，初次免疫時以他動物。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，周齡為宜，雌性鼠較便于操作。雌性鼠較便于操作。 12XXXXXXXXXXXXXXXXXX免疫程序的確定免疫程序的確定：在設計免疫程序時，應考慮到抗：在設計免疫程序時，應考慮到抗原的

7、性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。 13XXXXXXXXXXXXXXXXXX目前常用的免疫程序目前常用的免疫程序 14XXXXXXXXXXXXXXXXXX細胞融合和選擇性培養(yǎng)細胞融合和選擇性培養(yǎng) 15XXXXXXXXXXXXXXXXXX融合過程中，常采用聚乙二醇（融合過程中，常采用聚乙二醇（PEGPEG）作為融合誘導）作為融合誘導劑。劑。PEGPEG促進細胞融合的機制可能是與臨近細胞

8、膜的促進細胞融合的機制可能是與臨近細胞膜的水分相結合使細胞間的水分被取代，降低細胞表面水分相結合使細胞間的水分被取代，降低細胞表面的極性，導致脂質雙分子層不穩(wěn)定，引起細胞膜的的極性，導致脂質雙分子層不穩(wěn)定，引起細胞膜的融合融合 。注意注意：PEG PEG 的分子量和濃度與融合效果相關，的分子量和濃度與融合效果相關，PEG PEG 的分子量越大，濃度越高，其促融率也越高，但其的分子量越大，濃度越高，其促融率也越高，但其粘度和細胞的毒性也隨之增大；濃度低于粘度和細胞的毒性也隨之增大；濃度低于3030時，時，融合率低。融合率低。 16XXXXXXXXXXXXXXXXXX HAT選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)1

9、964年年Littlefield首先發(fā)明了首先發(fā)明了HAT (HHypoxanthine次黃次黃嘌呤，嘌呤，AAminopterin甲氨喋呤，甲氨喋呤，TThymidine 胸腺胸腺嘧啶核苷嘧啶核苷) 選擇性培養(yǎng)。選擇性培養(yǎng)。HAT選擇性培養(yǎng)基是根據次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷選擇性培養(yǎng)基是根據次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途徑設計的。酸生物合成途徑設計的。17細胞內細胞內DNADNA的生物合成途徑的生物合成途徑主要生物主要生物合成途徑合成途徑補救途徑補救途徑甲氨喋呤甲氨喋呤次黃嘌呤次黃嘌呤次黃嘌呤次黃嘌呤核苷酸核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶脫氧核苷酸脫氧核苷酸DNA

10、利用糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA葉酸拮抗物氨基蝶呤可阻斷主要途徑18 小鼠小鼠HGPRTHGPRT- -骨髓瘤細胞（骨髓瘤細胞（Sp2/0Sp2/0） 融合后的細胞在融合后的細胞在HATHAT選擇培養(yǎng)基中結局選擇培養(yǎng)基中結局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡死亡死亡 存活存活 19XXXXXXXXXXXXXXXXXX雜交瘤細胞的篩選及克隆化雜交瘤細胞的篩選及克隆化 20XXXXXXXXXXXXXXXXXX 克隆化克隆化：指將抗體陽性孔進行克隆化。目的是將抗體：指將抗體陽性孔進行克隆化。目的是將抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、特異性抗體分泌細胞和分泌細胞、抗體非分泌

11、細胞、特異性抗體分泌細胞和無關抗體分泌細胞分開。無關抗體分泌細胞分開。克隆化的克隆化的原則原則：盡早進行，反復：盡早進行，反復4-5次次克隆化方法：克隆化方法：有限稀釋法有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆、軟瓊脂平板法、顯微克隆法法陽性雜交瘤細胞應及時凍存，防染色體丟失、變異及陽性雜交瘤細胞應及時凍存，防染色體丟失、變異及污染污染21mm11443322424442333244444222443333333333有限稀釋法有限稀釋法 22XXXXXXXXXXXXXXXXXX大量制備及純化大量制備及純化大量制備大量制備 23XXXXXXXXXXXXXXXXXX純化方法純化方法1 1、鹽析、鹽析2

12、 2、凝膠過濾、凝膠過濾3 3、離子交換層析、離子交換層析4 4、親和層析法、親和層析法 24XXXXXXXXXXXXXXXXXX鹽析鹽析：用中性鹽使蛋白質沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，：用中性鹽使蛋白質沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，可奪取蛋白質的水化層，使蛋白質膠粒失水高濃度的鹽離子有很強的水化力，可奪取蛋白質的水化層，使蛋白質膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。發(fā)生凝聚而沉淀析出。 血清血清 50%飽和度硫酸胺飽和度硫酸胺 上清上清 （清蛋白）（清蛋白） 沉淀（球蛋白）沉淀（球蛋白） 33%飽和度硫酸胺飽和度硫酸胺 上清上清 沉淀沉

13、淀 擬球蛋白擬球蛋白 r球蛋白球蛋白 25XXXXXXXXXXXXXXXXXX 凝膠過濾法凝膠過濾法：干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋：干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質溶液加在凝膠柱上進行洗脫時，大分子蛋白不能穿過凝白質溶液加在凝膠柱上進行洗脫時，大分子蛋白不能穿過凝膠網孔進入。膠粒內，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最膠網孔進入。膠粒內，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫液最先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網孔進入膠粒內，受到凝膠先流出，小分子蛋白可穿過凝膠網孔進入膠粒內，受到凝膠的阻留，向下移動較慢洗脫出來較慢，據此將不同大小的蛋的阻留，向下移動較慢洗脫出來較慢，據此將不同大小的蛋

14、白質分離出來。白質分離出來。交聯葡聚糖凝膠交聯葡聚糖凝膠( (SephadexSephadex）瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠( (Sepharose)Sepharose) 26XXXXXXXXXXXXXXXXXX離子交換層析法離子交換層析法DEAEDEAE纖維素纖維素：結合溶液中帶負電荷的蛋白質，又稱：結合溶液中帶負電荷的蛋白質，又稱陰離子交換劑陰離子交換劑CMCM纖維素纖維素：結合溶液中帶正電荷的蛋白質，又稱陽：結合溶液中帶正電荷的蛋白質，又稱陽離子交換劑離子交換劑 27XXXXXXXXXXXXXXXXXX 將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中

15、的抗體（或抗原），形成抗原抗體復合附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復合物，然后改變條件，使抗原抗體復合物解離洗脫物，然后改變條件，使抗原抗體復合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）。出純化的抗體（或抗原）。 A A蛋白蛋白- -Sepharose CL 4BSepharose CL 4B親和層析法：親和層析法：28單克隆抗體的應用單克隆抗體的應用4 第四部分第四部分 29 XXXXXXXXXXXXXXXXX作為生物治療的導向武器作為生物治療的導向武器作為免疫抑制劑作為免疫抑制劑作為研究工作中的探針作為研究工作中的探針增強抗原的免疫原性增強抗原的免疫原性檢驗醫(yī)學診斷試劑檢驗醫(yī)學診斷試劑農獸藥的

16、快速檢測農獸藥的快速檢測作為親和層系的配體作為親和層系的配體單克隆抗體的應用單克隆抗體的應用 30XXXXXXXXXXXXXXXXXX作為親和層系的配體作為親和層系的配體單克隆抗體能與其相應的抗原特異性結合，因單克隆抗體能與其相應的抗原特異性結合，因而能能夠從復雜系統中識別出單個成分。只要而能能夠從復雜系統中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，固定在層析得到針對某一成分的單克隆抗體，固定在層析柱上，通過親和層析，即可從復雜的混合物中柱上，通過親和層析，即可從復雜的混合物中分離、純化這一特定成分。分離、純化這一特定成分。 優(yōu)點優(yōu)點：與其他提取方法相比，具有簡便、快速：與其他提取方法

17、相比，具有簡便、快速、經濟、產品活性高等優(yōu)點。、經濟、產品活性高等優(yōu)點。 31XXXXXXXXXXXXXXXXXX蛋白質提純蛋白質提純先用待提純蛋白質制成單抗，再將單抗固定在惰性固相先用待提純蛋白質制成單抗，再將單抗固定在惰性固相 基質上，制成層析柱。而后倒入混合液，當混合液流經單基質上，制成層析柱。而后倒入混合液，當混合液流經單抗時，相應的蛋白質與單抗特異性結合，雜質則隨洗脫劑抗時，相應的蛋白質與單抗特異性結合，雜質則隨洗脫劑流走。再用特殊的洗脫劑將蛋白質洗脫下來，則可將蛋白流走。再用特殊的洗脫劑將蛋白質洗脫下來，則可將蛋白質提純質提純。在親和層析中單克隆抗在親和層析中單克隆抗體是主要的配體

18、體是主要的配體 32 XXXXXXXXXXXXXXXXX作為生物治療的導向武器作為生物治療的導向武器以抗腫瘤為例：將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療以抗腫瘤為例：將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質連接，利用單克隆抗體的導向作用，將藥藥物或放療物質連接，利用單克隆抗體的導向作用，將藥物或放療物質攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤物或放療物質攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤導向治療。另外，將放射性標記物與單克隆抗體連接，注導向治療。另外，將放射性標記物與單克隆抗體連接，注入患者體內可進行放射免疫顯像，協助腫瘤的診斷。入患者體內可進行放射免疫顯像，協助腫瘤的診斷。常見抗腫

19、瘤細胞毒劑常見抗腫瘤細胞毒劑：化療藥物、細菌毒素、：化療藥物、細菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。植物毒素或放射性同位素等。這不僅提高了抗體的療效，也可降低細胞毒這不僅提高了抗體的療效，也可降低細胞毒劑對正常細胞的毒性反應。劑對正常細胞的毒性反應。 33 XXXXXXXXXXXXXXXXX作為免疫抑制劑作為免疫抑制劑抗人抗人T T淋巴細胞單抗（淋巴細胞單抗（McAbMcAb）作為一種新型免疫抑制劑，）作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥已廣泛應用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應，其作用機理有賴于反應，其作用機理有賴于McAbMcAb的種類及其免

20、疫學特性。的種類及其免疫學特性。例子例子：對于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經抗：對于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經抗T T細胞細胞單抗加補體處理，能夠減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。單抗加補體處理，能夠減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。 34 XXXXXXXXXXXXXXXXX作為研究工作中的探針作為研究工作中的探針利用單克隆抗體的特性可把它作為研究工作中的探針。此利用單克隆抗體的特性可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物時，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物質的結構與功能關系，進而可以從理論上闡明其機理。質的結構與功能關系，進而可以從理論上闡明其機

21、理。例子例子：用熒光物質標記單抗作為探針，能快速地確定與其：用熒光物質標記單抗作為探針，能快速地確定與其結合的相應生物大分子在細胞中的位置和分布結合的相應生物大分子在細胞中的位置和分布。 35 XXXXXXXXXXXXXXXXX佐劑能刺激佐劑能刺激吞噬細胞對吞噬細胞對抗原的處理抗原的處理可刺激致敏淋巴細可刺激致敏淋巴細胞的分裂和漿細胞胞的分裂和漿細胞產生抗體產生抗體增加抗原的表面積，增加抗原的表面積，使抗原易于被巨噬使抗原易于被巨噬細胞吞噬細胞吞噬改變抗體的產生類型以改變抗體的產生類型以及產生遲發(fā)型變態(tài)反應，及產生遲發(fā)型變態(tài)反應，并使其增強并使其增強可促進淋巴細胞之可促進淋巴細胞之間的接觸，增

22、強輔間的接觸，增強輔助助T T細胞的作用細胞的作用可提高機體可提高機體初次和再次初次和再次免疫應答免疫應答增強抗原的免疫原性增強抗原的免疫原性1改變抗原的物理性狀，可改變抗原的物理性狀，可使抗原物質緩慢地釋放，使抗原物質緩慢地釋放，延長了抗原的作用時間延長了抗原的作用時間將單抗制成佐劑加在疫苗里，則可減少疫苗接種時藥物的用量和避免多次接種并將單抗制成佐劑加在疫苗里，則可減少疫苗接種時藥物的用量和避免多次接種并不能引起機體更好地產生免疫應答，從而減少疫苗接種的風險不能引起機體更好地產生免疫應答，從而減少疫苗接種的風險。佐劑的佐劑的作用機理作用機理： 36 XXXXXXXXXXXXXXXXX細胞因子的測定細胞因子的測定激素測定激素測定腫瘤抗原的檢測腫瘤抗原的檢測免疫細胞及其亞群的的檢測免疫細胞及其亞群的的檢測病原微生物抗原、抗體的檢測病原微生物抗原、抗體的檢測作為檢驗醫(yī)學實驗室的診斷試作為檢驗醫(yī)學實驗室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強、劑，單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性好等優(yōu)點，廣純度高