1、SREBP2-STARD4在鄰苯二甲酸單丁酯促進膽固醇酯合成中的作用鄰苯二甲酸酯（ phthalate acid ester,PAEs）是一類人造多功能化學品,用于各種消費品和工業產品。 由于 PAEs在產品中為非共價結合 , 因此隨著時間的推移 ,PAEs 可以從產品中浸出、 遷移 , 通過攝入、吸入、皮膚接觸進入人體。 PAEs對生物體具有致癌 , 致畸和致突變作用 , 對生殖發育和神經系統也有毒性作用。鄰苯二甲酸二丁酯 （DBP）是最常用的鄰苯二甲酸酯之一, 在體內的代謝產物為鄰苯二甲酸單丁酯（ MBP）。本課題組前期研究發現,10-7M MBP暴露可以增加小鼠睪丸間質腫瘤細胞（MLTC

2、-1細胞）孕酮合成水平。在類固醇生成細胞中 , 膽固醇是合成孕酮的前體, 來自于以脂滴形式存儲的膽固醇酯的水解。對于 MBP是否可以影響膽固醇酯合成, 尚未有研究。在本研究中我們用MLTC-1細胞研究 SREBP2-STARD4途徑是否參與了 MBP促進膽固醇酯合成的過程。目的 :1 、探討鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）對膽固醇酯合成的影響2、探討類固醇激素合成急性調節蛋白4（ STARD4）在 MBP促進膽固醇酯合成中的作用方法:1 、MBP(10-8-10-5M) 處理小鼠睪丸間質細胞（MLTC-1）,酶標法測細胞內膽固醇酯含量。2、ORO法觀察 MLTC-1細胞內膽固醇酯的分布。3、qRT-

3、PCR法測定 STARD4和 SREBP2 mRNA表達。 4、Western Blot 法測定 STARD4和 SREBP2的蛋白表達。5、免疫熒光細胞化學法觀察 MLTC-1細胞內 STARD4表達變化。 6、應用 RNAi技術下調 STARD4的表達 , 再用 MBP(10-7M)處理 MLTC-1細胞 , 觀察MLTC-1細胞內膽固醇酯含量。 7、應用 RNAi技術下調 SREBP2表達 , 再用MBP(10-7M)處理 MLTC-1細胞 , 觀察 MLTC-1細胞內 STARD4蛋白表達水平和細胞內游離膽固醇含量。8、雙熒光素酶標記法檢測SREBP2與 STARD4啟動子區域結合活力

4、。結果 :1 、MBP促進 MLTC-1細胞中膽固醇酯的合成MLTC-1細胞暴露于10-8-10-5M MBP后 ,10-7M MBP劑量下發現細胞內膽固醇酯含量相比對照組明顯增加（p<0.05）,ORO染色發現 , 脂質染色相比對照組明顯加深。2、 STARD4在 MBP促進 MLTC-1細胞膽固醇酯合成中的作用 qRT-PCR和 Western Blot結果表明 ,10-7M MBP 處理后 ,MLTC-1細胞 STARD4 mRNA和蛋白水平與對照組相比均上升（p<0.05）。免疫熒光細胞化學染色聯合激光共聚焦法結果顯示,10-7M MBP處理后 ,STARD4在內質網上聚集

5、增多。 RNAi實驗結果發現 ,STARD4表達水平與細胞內膽固醇酯水平相關 , 且再用 10-7M MBP處理 MLTC-1細胞后 ,STARD4蛋白表達上升 , 細胞內膽固醇酯合成增加（p<0.05）。 3、 MBP對SREBP2基因表達的影響qRT-PCR和 Western Blot實驗結果發現 ,MBP可促進SREBP2mRNA和蛋白表達水平升高。采用 RNAi技術抑制 SREBP2表達后 ,MLTC-1 細胞中 STARD4蛋白表達下降 , 再用 MBP(10-7M)處理 MLTC-1細胞 ,SREBP2蛋白表達水平回復（ p<0.05 ）。 4、MBP通過 SREBP2-STARD4促進膽固醇酯合成采用 RNAi抑制SREBP2表達后 ,MLTC-1細胞中 STARD4蛋白表達下降 , 細胞內游離膽固醇含量增加。再用 MBP（ 10-7M）處理 MLTC-1細胞 ,SREBP2和 STARD4蛋白表達水平回復 , 細胞內游離膽固醇含量降低（p<0.05）。采用雙熒光素酶標記實驗發現,SREBP2可與 STARD4啟動子區域結合 , 且MBP(10-