1、摘要：對于誘導細胞毒T淋巴細胞（CTL）的可靠和有效的方法一直是研究的熱點，本次試驗主要在于動物模型的研究，這種動物模型允許測試新穎的疫苗策略并且最終實現一個更有效率的臨床試驗的計劃。在這里，由一串部分重疊的CTL表位（20個人，3只貓猴和1只老鼠）傳遞和表達人類免疫缺陷病毒（HIV） 疫苗候選人被創建通過使用質體DNA和被修改病毒安卡拉（MVA；一個衰減痘苗病毒）,它們是兩種可接受的疫苗工具為了在人類使用。在老鼠中，在單一的靜脈肌肉注射后這些疫苗被表現誘導病毒特異性干擾素的產生和細胞毒CD8+TI田 胞，隨著免疫試驗方案被尋找來提高誘導特異性的 HIV白T細胞水平， DNA首要的-MVA的提

2、升被發現作為最有力的試驗方案，這種多態表 位的DNA也引出CTL當用Accell?基因槍傳遞裝置在細胞內傳送。基因傳遞裝置（基因槍），最后，一個組合的內部的基因槍 DNA HMVA 疫苗方法誘導在貓猴高頻率的循環 CTL,這種高頻率CTL與在猴子所 觀察到的猿類免疫缺陷病毒（SIV）感染的猴子。對這種方法的優化在 非人類的靈長類也正在進行，因此，為了有效的引出CTL一個免疫的方 法已經被發現，這種方法很可能促進這些淋巴細胞在控制SIV和HIV感染中起評價的作用。關鍵詞： HIV 疫苗； CTL 多態位； DNA 首要的 MVA 的提高1.引言一個有效的疫苗是最希望來控制獲得性免疫缺陷病綜合癥（

3、AIDS）的恐慌。通過保護免疫組織不被人體免疫缺陷病毒 （HIV）感染 的這種疫苗將起幫助的作用，盡管一個 HIV疫苗可能誘導CD8+和 CD4+ T 細胞的反應，以及中和抗體，但是缺乏這些誘導的人群中也能說明這些組成成分在保護中的作用。對于這種方法最主要的障礙是在于識別足夠地高的CD8+T 細胞的反應，和識別抗體中和最初的HIV 分離。識別這些反應的疫苗作為重大進展朝著預防HIV 感染或衰減它的方向，從而長期地延緩HIV 的發作。CD8 +T 細胞在參與機體的防御不止一個方面：它們通過殺傷被感染的細胞來阻止病毒的繁殖，和分泌一系列的細胞因子如IFN-r 和腫瘤壞死因素，直接或間接有助于控制病

4、毒的感染。這一新興的數據顯示在CD8 +T 細胞艾滋病病毒感染所有階段起到了核心的保護作用： CD8 +T 細胞的存在而不是與起初感染的病毒血癥控制有關的中和抗體；他們很容易發現許多無癥狀的個體和圍繞著的細胞毒T 淋巴細胞（CTL）多次與逆轉病毒的聯系，艾滋病的CTL逃逸突變體在某些情況惡化被孤立；隨著疾病的進展細胞毒性的降低；在未感染的的人群中CTL 被發現，但是已經感染HIV 的婦女和在未受感染的攜帶 HIV 病毒的母親所生嬰兒（這句不會翻譯）。這是公認的為了實際的和安全的原因，病毒的亞單位而不是全滅活或者是被減弱的艾滋病病毒的制劑極有可能被用來作為AIDS的疫苗。 抗原表位的使用來自幾個

5、不同的蛋白在蛋白質數量上的降低了或在接種疫苗時遺傳物質的傳遞，增強免疫應答集中在主要的或者保守的蛋白質區域，降低非重疊的區域（免疫致病原或者免疫抑制）和篩 選混合的單一的多態位點（分支疫苗）。表位疫苗的障礙是MHC的抗原決定簇，這些抗原決定簇引起不同的 T細胞具有不同的抗原表位。然而， 據估計五個常見的人類白細胞抗原類型可能在白人和東方的人群中包括 80-90% ，和由9個人類白細胞抗原分子的表位會被要求對于一般人群覆蓋面無關種族血統，如果每個人超過一個相關的表位被需要，一個廣泛有效的表位疫苗的復雜性也會增加，而且是可行的。重點對新疫苗的策略的評估是使用動物模型，小動物模型對于起初的免疫原性研

6、究是有用的，這種研究使用大量的動物的成本便宜。對于 HIV 和 AIDS 病毒而言，根據在疾病的嚴重性和防止病毒感染難點上， 為帶有免疫缺陷病毒的非人類靈長類動物的感染提供一系列的模型。這些模型從含有HIV-1 SF2 的黑猩猩的感染到含有SIV_mac的恒河猴的感染，這種感染很容易被中和抗體保護，受感染的部位在部分或完全地依賴細胞介導的免疫反應。這些模型允許免疫設計的重要方面和以更快、更便宜的方法對免疫方案的擬定與在人類中的研究進行比較，并且最終提供更有效率的臨床研究計劃。此外，一個臨床前具有 AIDS 疫苗的人的進展被描述。2 .實驗設置2.1 DNA 多 CTL 表位疫苗一個艾滋病疫苗的

7、原型被構造，這基于合成的基因編碼對于一系列部分重疊的表位，指定H區。這種CTL多表位肽蛋白質有20個人的 表位（受12個不同的HLA等位基因的限制），3個貓猴表位和1個鼠表 位組成，因此在老鼠,獼猴和人類中同種疫苗可以被測試他們的CTL免疫原性（免疫遺傳性），為了使在老鼠中兩種不同的表位誘導產生特異性的T細胞，另一個多表位基因包含一個瘧原蟲鼠科表位與 H基 因末端3%產生HM基因，直接無害的DNA是一種特異性的活性疫苗， 這種疫苗已成功用于誘導體內的體液和細胞介導免疫反應，包括MHC-I 分子的 CD8+T 細胞，一種用于向量鍍通孔（一種新型的載體pTH被設計）DNA免疫被構造，用于使H和HM

8、基因被插入。在瞬間轉 染的培養細胞內這些載體表達高水平的重組多肽。用DNA疫苗在老鼠靜脈肌肉注射產生細胞毒性因子（ 23% 殺死在靶細胞比率為100:1）和干擾素r的產生（300每106脾細胞）CD8+T細胞特異性對于兩鼠表 位。2.2 . MVA多CTL表位疫苗MVA是一種減弱痘苗病毒應變而在雞胚細胞生長得很好，但實質 上失去了它在哺乳動物細胞復制的能力，此外， MVA已失去了幾個 基因編碼免疫調節蛋白如可溶性的載體對 IFN-r, IFN a:b,腫瘤壞死因 子，CC趨化因子。更為重要的是，MVA已經被證實是安全被用于超過 120萬人類。重組的MVA攜帶H和HM基因被構建，靜脈注射小鼠（i

9、.v.） or i.m. 使用單一劑量的106血小板形成單位（pfu） of MVA和CTL的誘導被估 計。研究結果表明兩種方式誘導特異性的 CTL反應持續了至少55天， 和在i.v.的途徑是緩和地比免疫遺傳比i.m.途徑多（分別42和33%正 在死亡，防御較多的HIV表位在靶細胞的比率100:1）。ex vivo脾淋巴 細胞的頻率產生干擾素與MHC I類分子結合被確定用ELISPOT分 析，每106脾細胞平均283和227個細胞各自在i.v. and i.m.的HIV表 位。3 .結果3.1 T細胞誘導的增強由一個起初的DNA MVA疫苗方法的提高 我們探究免疫的方案，該方案將能夠提高誘導H

10、IV特異性T細胞的水平。據發現之前的免疫對MVA 暴露， MVA 降低之前的效果和使用相同的疫苗的方法加強。然而，以動物重組的方法是第一個帶有DNA的疫苗，和MVA提高是最有力的方案適合于在干擾素r的產生 （ 1000個細胞每106脾細胞）和細胞毒 （ 55%殺死靶細胞的比率是100：1） CD8+T細胞對兩個CTL表位的不利。3.2 Accell基因槍傳遞能夠在一種雙模型的疫苗方法替代 DNA的注射 基因槍介導的免疫傳遞被包裹的DNA金粉顆粒進入表皮，一個主 要的免疫誘導位點，和要求在靈長類動物中少于100 1000的重復序列。通過內部肌肉時有很多重要的優勢， 具有多表位DNA載體的CTL的

11、有效誘導被實現通過疫苗，這種疫苗是使用基因槍或者重組疫苗的方法（70%殺死靶細胞的比率是100: 1）。因此，攜帶多CTL表位基 因的基因槍介導的免疫和能夠在 DNA起初MVA提高疫苗方案中替 代注射 DNA。3.3 在非靈長類動物中誘導高水平的CTL在過去， 一些在小鼠內的疫苗免疫遺傳不能誘導在人體內的免疫反應。因此，測試多表位疫苗在人類的臨床試驗是十分重要，這個疫苗含有一個MHC等位基因抑制SIV的表位和三個MHC等位基因激活SIV的表位，和三個Mamu-A*01陽性 恒河猴使用PCR-SS限術被選 擇，以及用Accell基因傳遞裝置的DNA疫苗的二倍被用5x108pfu的 MVA （周1

12、7 22周）兩種胞內免疫，在最后的免疫之后 PBL被隔離 一周，在細胞外的肽的表達和CTL 的溶解的確定。這種疫苗的方法誘導CTL的反應，該反應的結果是分別加入48,50和66%肽特異性與靶細胞的比率高各自是37:1,45:1 和 14:1, 35周溶血的淋巴細胞能夠裂解PHA刺激SIV感染的PBL。高頻率循環的SIV特異性T細胞被疫苗誘 導，這種T細胞被證實通過使用可溶性四聚體 Mamu-A*01-肽復合物和 波動達到CD8+淋巴細胞的最大值1 % （未出現的結果），因此DNA 首要的MVA提高疫苗方案誘導的有效性和持續性地的高頻率的 CTL 不僅在小鼠中存在，而且在非人類的靈長類的動物與人

13、類的尺寸比較和免疫反應比較接近，抵御SIV感染的疫苗有效性被檢測。人類CTL的克隆和對四種HLA限制HIV表位的方法用來檢測這些表位加工和呈遞的過程在受感染的具有MVA.H 或 MV.HM 人類細胞是可靠的，所有的這四個表位完全的來源于人類細胞，并且CTL 裂解這些敏感的受感染的靶細胞。4 . 討論4.1 為什么DNA-MV A方法誘導CTL是有效的？這項研究中通過篩選HIV 疫苗有幾種可能的原因對于誘導有效的 CTL。 首先， 兩種疫苗接種于表皮，在表皮這些多表位蛋白被最大量的產生通過角質化細胞和Langerhans 細胞。這些抗原呈遞細胞在抗原集中的部位是最有效的抗原識別和介導免疫反應的細

14、胞，在老鼠體內，比起在靜脈肌肉注射中這種免疫途徑是更有效的，其次，基本的免疫反應是使用DNA 作為免疫工具，為了獲得起始的CTL 重組免疫原，簡單的說是因為僅僅只是一個外源蛋白的表達，盡管重組天花病毒很可能有較多的免疫基因比DNA 載體作為免疫工具，但是病毒感染細胞能產生大量的病毒多肽位點由MHC I 類呈遞， MHC I 類分子能夠競爭重組免疫原為CTL 免疫瞄定。以前，盡管所有的這些疫苗反應是針對牛痘抗原，但是僅有少數的疫苗被免疫即用重組的疫苗對細胞內的蛋白進行免疫。因此，提高 MVA， DNA 靶動物已經極大地提高特異性免疫原CTL 的活性。 第三， 使用 MVA 而不是牛痘病毒或天花病

15、毒是很有用的，由于特殊的免疫調節分子的爆發即MVA 的表達。 MVA 產生強烈的I 型干擾素反應，這很可能用于CTL的表達，第四，這種特異性的多CTL, 表位在轉染的細胞中是無毒，歸因于一系列的多肽進入大的胞囊泡中。細胞長時間的產生免疫原，直到免疫應答清除。最后， 一些機體出現的數據表明具有不同的疫苗方法重組的疫苗方案，或者是對于免疫系統的抗原呈遞誘導的免疫反應時是十分有效的。4.2 CTL 怎樣預防免疫缺陷病毒的感染？CTL本身不能夠阻止受感染的宿主T細胞內的病毒細胞，但是， 如果在相關的組織或者其周圍有高劑量的記憶 CTL呈遞細胞，和病毒 的感染性很低時，CTL能及時清除這些小量的感染細胞

16、在病毒迅速傳 染和產生子代病毒時。在人類中，能鑒別 HIV特異性的CTL反應的發 生，但是未感染的類群上升的可能性，CTL可能保護或者防御HIV病毒的感染。在SIV貓猴模型中，控制SIV的感染與MHC I類分子的 Mamu-A*26等位基因有密切的聯系，使用四聚體復合物，同樣的 Mamu-A*01-被抑制肽在這次研究中被使用表明在受SIV感染的猴子中免疫占主導并地位，然而，到目前為止已經有兩項研究攜帶疫苗誘導的 CTL 的動物在抵制這種表位上遭到質疑，和不完全地被保護，盡管有所下降在病毒被觀察到（S. Norley, Paul-Ehlrich 研究所），在這些研究中CTL 的水平可能比在我們所研究的動物中低一些，預防 SIV感染的措施需要依靠疫苗誘導的CTL 的強度， 和 12-肽 p11C 被用來提高在以前的研究中可能已經誘導潛在的CTL 反應，抵制蛋白質的表達的高水平的CTL 在再生循環中能更好的阻止感染比晚期結構蛋5 .結論最初的多CTL 表位 AIDS 疫苗被構建通過對這些疫苗的選擇為了適合應用于人類，在老鼠中它們的免疫遺傳性被證明和一個混合的免疫方