1、乳酸菌的分離、純化與鑒定第一部分：乳酸菌的分離、純化一、實(shí)驗(yàn)器材：1 .實(shí)驗(yàn)藥品新鮮乳酸飲料（市售）、脫脂奶粉、蔗糖、1.6%溟甲酚綠乙醇溶液（澳甲酚綠、無水乙醇）、酵母膏、瓊脂、革蘭氏染液（結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%L 醇、沙黃）、75%醇、香柏油、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、碳酸鈣；0.4gNaOH固體、4.2ml濃HCL（分析純）、20gCaCO3固體、酵母膏20g、瓊月旨30g香柏油、脫脂奶粉100g、蔗糖10g;2 .儀器與設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、培養(yǎng)箱、pH 試紙、酸乳瓶、培養(yǎng)皿（小9 或 612）、試管、300ml 三角瓶（帶玻珠）、移液管、天平、500

2、ml 錐形瓶、250ml錐形瓶、250ml 燒杯。二、實(shí)驗(yàn)步驟：1 .培養(yǎng)基配制（BCGBCG牛乳培養(yǎng)基）：（A） 溶液： 取脫脂乳粉 100g,水 500ml,加入 1.6%溟甲酚氯乙醇溶液 1ml,混合均勻后分裝入三角瓶于高壓蒸汽滅菌鍋 80c 滅菌 20min; （1.6%溟甲苯酚綠（BCG 乙醇?液用 1.6g 澳甲酚綠加入 20ml 無水乙醇中，再加水至 100ml 制成）（B）溶液：酵母膏 10g,水 500ml,CaCO310g 瓊脂 20g,加熱溶解，用精密 pH 試紙調(diào)節(jié) pH 到 6.8,分裝入三角瓶后在 103kPa121C 高壓蒸汽滅菌 20Min。以無菌操作趁熱將（A

3、）（B）溶液均勻混合。2 .藥品配制2.1 結(jié)晶紫：結(jié)晶紫乙醇飽和液（結(jié)晶紫 2g 溶于 20ml95*醇中）20ml,1%T 酸氨水溶液 80ml。將兩液混勻，放置 24 小時后過濾即可。2.2 盧哥氏碘液：碘 1g,碘化鉀 2g,蒸儲水 300ml。先將碘化鉀溶于少量蒸儲水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸儲水 300ml 即成。2.3 蕃紅溶液：番紅 2.5g,95%酉 I100ml,溶解后存于密閉的棕色瓶中。用時取 20ml 與80ml 蒸儲水混勻即可。2.4 0.1%的呂氏美藍(lán)染液：A 液：美藍(lán) 0.3g,95%醇 300ml;B 液：0.01%KOH100ml混合 A 和 B 液

4、即成，按 1:100 稀釋即可。2.5 生理鹽水：稱取 9g 氯化鈉，溶解在少量蒸儲水中，稀釋到 1000 毫升。3 .菌懸液的配制取 1 潔凈三角瓶，盛以 225ml 生理鹽水；7 只潔凈試管，各盛 9ml 的生理鹽水；加塞包扎于在 103kPa121c 高壓蒸汽滅菌 20Min,得到無菌生理鹽水。將酸奶樣品攪拌均勻，用無菌移液管吸取樣品 25ml 加入盛有 225ml 無菌生理鹽水的三角瓶中，在旋渦均勻器上充分振搖，使樣品均勻分散，即為 10-1 的樣品稀釋液；將 7 只裝 9ml 生理鹽水的無菌試管，依次標(biāo)記 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,再用無菌移液管吸

5、10-1 的菌懸液 1ml 放入依次裝有 9ml 無菌水的試管中， 稀釋混勻便得到 10-2 稀釋液，如此重復(fù)依次制得 10-310-7 的稀釋液。4.倒平板取無菌平板 12 個，編號標(biāo)明 10-1、10-5、10-6、10-7 各三套；將經(jīng)高溫消毒的培養(yǎng)基冷卻到 50c 左右，按無菌操作法倒 12 只平板，每皿約 15ml;平置使培養(yǎng)基均勻分布在皿底，待凝固。1).分離方法A.平板劃線接種環(huán)挑取 10-1 菌液， 按無菌操作對標(biāo)有“10-1”的 3 個平板進(jìn)行劃操作； 劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置放在 40。叵溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 小時。B.平板涂布用三支 1ml 無菌移液管分別吸取 10-5

6、、10-6 和 10-7 的稀釋菌懸液各 1ml,對號接種于與之對應(yīng)的 3 個無菌平板中， 每個平皿放 0.1ml;盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于試驗(yàn)臺上 20Min；然后倒置于 40。叵溫箱中培養(yǎng) 48 小時。6.脫脂乳試管的配制與滅菌直接選用脫脂乳液或按脫脂奶粉 10 克與蔗糖 5 克，水 95 克（蔗糖與水的比例在1:10 的范圍內(nèi)）的比例配制，裝量以試管的 1/3 為宜，115c 滅菌 15min7.菌落觀察恒溫培養(yǎng) 48 小時過后，取出培養(yǎng)平板；選擇菌落分布較好的平板，先對其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大約 13mm 園形隆起，表面光滑或

7、稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黃色；在產(chǎn)酸菌落周圍還能產(chǎn)生 CaCO3 勺溶解圈。 40c 培養(yǎng) 48h,如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者初步定為乳酸菌。.乳酸菌的分離純化選取乳酸菌典型菌落轉(zhuǎn)致脫脂乳試管中，40c 培養(yǎng) 824h 若牛乳出現(xiàn)凝固，無氣泡， 顯酸性， 涂片鏡檢細(xì)胞桿狀或鏈球狀， 革蘭氏染色顯陽性， 則可將其連續(xù)傳代 3 次，最終選擇出在 36h 能凝固的牛乳管，作菌種待用。.乳酸發(fā)酵及檢查發(fā)酵： 觀察 BCGf 養(yǎng)基中乳酸菌菌落特征， 選取長勢比較好的菌落無菌操作下將乳酸菌接種于裝有脫脂乳的試管中，4042C 靜止培養(yǎng)。取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽

8、水，無菌操作法取少量菌體涂片；結(jié)晶紫初染-碘液媒染-乙醇脫色-番紅復(fù)染，干燥后用油鏡觀察，菌體被染成藍(lán)紫色的是乳酸菌；其中保加利亞乳桿菌呈桿狀，成單桿、雙桿或長絲狀；嗜熱鏈球菌，呈球狀，成對或短鏈或長鏈狀。革蘭氏陽性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌，記錄測定結(jié)果。第二部分：乳酸菌鑒定一、實(shí)驗(yàn)器材.蛋白陳水培養(yǎng)基：蛋白陳 10g,氯化鈉 5g，水 1000ml,PH:7.27.4121 攝氏度濕熱滅菌 20min.糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白陳水培養(yǎng)基 1000ml,1.6%溟甲酚紫乙醇溶液 12ml,PH:7.6,另配20%溶液（葡萄糖，蔗糖）各 10ml.有關(guān)試劑1.6%澳甲酚紫乙醇溶液：澳甲酚紫 1

9、.6g 溶于 100ml 乙醇中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆眠冗湓噭簩Χ谆被郊兹?8g,95%乙醇 760ml,濃鹽酸 160ml.10%硫酸，2%高鈕酸鉀含氨的硝酸鹽溶液：稱取硝酸銀 2g,蒸儲水 100ml，待硝酸銀溶解后，取出 10ml備用，向其余的 90ml 硝酸銀中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，繼續(xù)滴加氨水至沉淀剛剛?cè)芙獬蔀槌吻迦芤簽橹梗賹溆玫南跛徙y慢慢滴入，則溶液出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀的沉淀又消失，繼續(xù)滴入硝酸銀，直到搖動后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。二、鑒定試驗(yàn).形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察采用牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基，將已純化后的甘油菌種活化后于 37c 下培養(yǎng) 2024

10、h,并進(jìn)行革蘭氏染色及菌體形態(tài)和菌落特征的觀察。染色方法：涂片固定；草酸錢結(jié)晶紫染 1 分鐘；自來水沖洗；加碘液覆蓋涂面染約 1 分鐘；水洗，用吸水紙吸去水分；加 95%酉精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，20 秒后水洗，吸去水分；蕃紅染色液（稀）染 2 分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。.生長條件試驗(yàn)（1）耐鹽性試驗(yàn)（NaCl 濃度:0.85、1.20 和 1.71）（mol/L）;耐酸堿試驗(yàn)（pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.6 和 8.7）;（3）溫度梯度試驗(yàn)（溫度：10C、30C、40C、50C、55C、60c 和 65C）。分別將參試菌接種于以上處理的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 48h，記錄生

11、長狀況。.厭氧生長測定將菌種接入營養(yǎng)肉湯平板后，用密封帶包好放入 CO 邸養(yǎng)箱 37c 培養(yǎng) 2 天后,觀察生長情況，生長則為陽性。含硝酸鉀的營養(yǎng)肉湯加入 2g 硝酸鉀入營養(yǎng)肉湯.生理生化試驗(yàn)過氧化氫酶測定將實(shí)驗(yàn)菌接種于 PGYW 養(yǎng)基余面上，37C 培養(yǎng) 20h24h,取一環(huán)接種的培養(yǎng)物，涂于干凈的載玻片上,然后在其上滴加 3 好一 15%勺過氧化氫，有氣泡則為陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。蛋白陳、酵母膏、葡萄糖(PGY 培養(yǎng)基：蛋白陳 10g,酵母膏 5g,葡萄糖 1g,蒸儲水1L。甲基紅(M.R)試驗(yàn)接種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌于 PYG 培養(yǎng)基，于 37c 培養(yǎng) 2 天后，于培養(yǎng)物中加入幾滴甲基紅酒精溶

12、液，如呈紅色，表示陽性。呷咪試驗(yàn).試管標(biāo)記：取裝有蛋白陳水培養(yǎng)基的試管 2 支，分別標(biāo)記乳酸菌和空白對照。.接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌的試管中，標(biāo)記有空白對照的不接種，置 37 攝氏度恒溫箱中培養(yǎng) 2448 小時。).觀察記錄：在培養(yǎng)基中加入乙醴 12ml,經(jīng)充分振蕩，使呷珠萃取至乙醴中，靜置片刻后乙醴層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入 510 滴呷咪試齊 L 如有呷珠存在，乙醴層呈玫瑰色，此為呷珠試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。.糖發(fā)酵試驗(yàn).試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各 2 支，每種糖發(fā)酵試管中分別標(biāo)記乳酸菌和空白對照。.接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接

13、種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置試管中，置 37 攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時，觀察結(jié)果。.觀察記錄：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原由顏色，具反映結(jié)果為陰性；如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽性。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)。.乳酸的檢測選用已經(jīng)分離的菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取發(fā)酵液的上清液約 10ml 于試管中，加入10 蜥酸 1ml,再加 2%(鈕酸鉀 1ml,此時乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。(6)乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P 試驗(yàn))接種新鮮的實(shí)驗(yàn)菌種于培養(yǎng)基中,37c 培養(yǎng) 2 天后,取葡萄糖蛋白陳培養(yǎng)液 1mL 在其中加入 1ml10%的 NaOH 混勻，再加入 34 滴 2%氯化鐵溶液。數(shù)小時后，培養(yǎng)基表面的下層出現(xiàn)紅色者，為陽性.(7)明膠液化實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)菌接種于明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置 37c 培養(yǎng)，以一支未接種的試管作為對照。將接種的和未接種的對照管置于冰箱或冷水中，等待對照管凝固后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反復(fù)觀察對比多次。如對照管凝固時，接種管液化為陽性反應(yīng)，凝固為