1、大鼠急性脊髓損傷熱休克蛋白47的表達變化 作者：何玉寶 楊晨 楊有庚 任憲盛【摘要】 目的 研究老年大鼠急性脊髓損傷（SCI）中熱休克蛋白47(HSP47)的表達情況。方法 用54只Wistar大鼠制作鉗夾型SCI模型，在SCI后3 d及每周評價BBB評分，并在1、3、5 w用免疫組化方法分析脊髓中HSP47的表達情況。結果 正常Wistar大鼠脊髓組織低表達HSP47，在SCI后表達明顯提高，且在第5周仍有上升趨勢（P0.01）。脊髓損傷后灰質、白質分界不清，細胞凋亡明顯，HSP47主要在血管及靠近軟脊膜處白質中表達。結論 老年Wistar大鼠SCI 后HSP47表達增加，HSP47可能參與

2、到SCI的病理改變過程中。 【關鍵詞】 急性脊髓損傷；熱休克蛋白47；鉗夾型急性脊髓損傷模型老年患者由于脊柱和間盤的退行性改變，急性脊髓損傷（SCI）發病危險更高。膠質瘢痕是脊髓損傷修復的阻礙因素之一1，而熱休克蛋白47（HSP47）在瘢痕形成的過程中起到重要的作用2。但是對于HSP47在SCI后的表達情況國內外文獻尚未見報道。本研究擬通過免疫組化技術研究SCI后HSP47的改變，探索治療脊髓損傷的新靶點。1 資料與方法1.1 實驗動物Wistar大鼠（清潔級）54只，鼠齡12個月，體重200250 g，吉林大學實驗動物中心提供。1.2 實驗試劑及儀器HSP47（1200，Santa Cruz

3、公司），膠質細胞酸性蛋白(GFAP，150）、神經絲蛋白(NF，1100，武漢博士德生物工程有限公司)，UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒（福州麥新生物技術開發有限公司），多聚賴氨酸（北京中杉金橋生物技術有限公司），甲苯胺藍（北京化學制劑公司），石蠟配量機、石蠟包埋機、手動輪轉切片機（德國LEICA公司）等。1.3 大鼠鉗夾型SCI模型的建立3 54只大鼠隨機分為正常組，假手術組，SCI組，每組18只。假手術組單純行T10椎板減壓；SCI組接受T10節段的脊髓鉗夾損傷。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g體重)，麻醉滿意后，取俯臥位，固定，

4、以肋骨下緣為中心背部剪毛，消毒，按肋骨確定椎體序列，在T8T12水平剪開皮膚，長約3 cm。剪開深筋膜，尖刀緊貼棘突骨面縱形分離椎旁肌，直達椎板表面，顯露出T9T11的椎板和棘突，直至關節突。上自動撐開器，血管鉗固定T9T10棘突，蚊式止血鉗咬除棘突、椎板至關節突內側面，暴露出脊髓硬脊膜，并用動脈夾鉗夾脊髓，發現鉗夾后尾巴抽搐癱瘓。明膠海綿止血徹底后局部撒青霉素粉末20萬U，逐層縫合肌肉、深筋膜、皮膚，再次消毒。術后分籠飼養，每日2次人工排尿，直至恢復排尿，大約23 w。青霉素每次5萬U/100 g體重，2次/d，腹腔注射1 w。1.4 BBB評分4所有動物分別在SCI后3 d及每周評價BBB

5、評分。將動物置于直徑為2 m的圓形平臺上，觀察記錄其后肢的行走及肢體活動。評分分3部分：第1部分為07分，評判動物后肢各關節活動；第2部分為813分，評判后肢的步態及協調功能；第3部分為1421分，評判運動中爪的精細動作，3項滿分為21分。1.5 HE染色、尼氏染色和免疫組化染色正常組、假手術組和SCI組在1、3和5 w分別處死6只。10%水合氯醛腹腔注射(0.3 ml/100 g體重)，達深度麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，自左心室通過靜脈導管至升主動脈，切開右心房，快速灌注100 ml 0.01 mmol/L PBS緩沖液沖洗血管，待右心耳留出液體基本無色，繼以150 ml含10%中性福爾馬林

6、緩沖液灌注固定。自背部打開椎管，取出脊髓損傷區為中心的脊髓組織長約2 cm，并以10%中性福爾馬林緩沖液4下固定24 h后，以脊髓損傷區為中心修塊，長約3 mm。然后各級酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。切片機以脊髓損傷區為中心切片，片厚2.0 m。切片脫蠟至水，行HE、尼氏染色和SP法染色5。各級酒精脫水、二甲苯透明、樹膠固封。用0.01 mmol/L PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。1.6 HE染色、尼氏染色和免疫組化染色結果判定HE染色后細胞質呈紅色，細胞核呈藍色。尼氏染色后尼氏體呈紫藍色，胞核呈藍色。免疫組化陽性表達為胞漿內或者軸突內出現棕黃色顆粒。在低倍鏡（10倍）下選取陽性表達

7、密集區，在高倍鏡（400倍）下觀察細胞形態、染色定位和程度。每個時間點選取6張切片，每張切片隨機選取5個不同重疊視野，輸入計算機分析累積光密度值。1.7 統計學分析實驗數據均以x±s表示，采用LDS檢驗法對結果進行統計分析，結果由SPSS13.0輸出。2 結 果2.1 BBB評分正常組和假手術組大鼠雙后肢BBB評分均為21分，SCI組損傷后3 d BBB評分為0.67±0.48，表明SCI模型成功；隨著時間延長，評分逐漸上升，表明損傷正在修復，見圖1。2.2 免疫組化結果見圖2。HE、尼氏染色可見正常組和假手術組脊髓灰質呈典型的蝴蝶形狀，灰質和白質邊界清晰，而SCI組脊髓正

8、常形態消失，空腔形成，灰質和白質分界消失，神經纖維排列紊亂、減少，神經細胞變性、壞死、凋亡，膠質細胞增生。HSP47主要表達在血管周圍及靠近軟脊膜處白質中。免疫組化累積光密度值分析見表1。與正常組和假手術組相比，SCI組HSP47表達水平高，且隨時間的改變表達量增加（P0.05）。表1 各組大鼠脊髓中HSP47光密度的比較（略)3 討 論 SCI后血管完整性和通透性遭到破壞，血管周圍增加的型膠原一方面占據了本來就很狹小的椎管空間，另一方面阻礙重建的血管與周圍細胞氧和營養物質的交換，在血管重建過程中起到阻礙的作用。型膠原的生成利于膠質瘢痕的形成而妨礙了脊髓神經元的軸突再生，不利于軸突穿過膠質瘢痕

9、。 實驗已經證明HSP47和膠原合成有關6。研究表明在內質網中，HSP47不僅參與型膠原的正確折疊，而且還阻止不正確折疊。HSP47在隨后型膠原的分泌、加工和纖維化形成中起關鍵作用；在HSP47/細胞中應用基因敲除技術證明了HSP47在型膠原分子成熟中的重要性7。 SCI后盡管出現了細胞變性、壞死和凋亡，細胞數目減少，但是HSP47表達明顯升高，主要分布在血管周圍及靠近軟脊膜處白質中，進一步證實了HSP47的表達增加阻礙了血管的再生。SCI后第1周HSP47即出現升高趨勢，且在第5周仍有上升趨勢，說明針對HSP47為靶點的治療應該在SCI后立即給予干預，且應該持續到第5周以上?！緟⒖嘉墨I】 1

10、 XiaY，Zhao T,Li J,et al.Antisense vimentin cDNA combined with chondroitinase ABC reduces glial scar and cystic cavity formation following spinal cord injury in ratsJ.Biochem Biophys Res Commun,2008;377(2):5626.2 Takashi T，Razzaque MS. The collagenspecific molecular chaperone HSP47: is there a role i

11、n fibrosisJ? Trends Mol Med,2006;13(2):4553.3 Kao CH,Chen SH,Chio CC,et al.Exogenous administration of glial cell linederived neurotrophic factor improves recovery after spinal cord injuryJ.Resuscitation,2008;77(3):395400.4 Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in ratsJ.J Neurotrauma,1995;12(1):121.5 屈淑賢,謝曉冬,鄭振東,等.免疫組化SP法檢測人乳腺癌組織中VEGF和VEGFC的表達及意義J.現代腫瘤醫學,2007;15(11):15824.6 Razzaque MS,Taguchi T.Pulmonary fibrosis:cellular and molecular eventsJ.Pathol Int,2003;53(3):13345.7 Ishida Y，Kubota H，Yamamo