1、分子生物學(xué)綜述肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因分析和基因治療進(jìn)展姓名：胡莉琴學(xué)號(hào)：416522811456專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)單位：南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因分析和基因治療進(jìn)展ABSTRACT:OBJECTIVE: Explore amyotrophic lateral sclerosis in the virulence genes and gene therapy are reviewed.DATA SOURCES: An computer-based online search of Pubmed database was undertaken to indentify articles pu

2、blished in English between 1993 and 2011 by using the keywords of “amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy” Chinese relevant article published from 2005-2011 were searched with computer in WEI PU.STUDY SELECTION；The data were checked firstly, the articles on amyotrophic lateral sclerosis wer

3、e collected. Inclusive criteria: Research amyotrophic lateral sclerosis of virulence genes; Amyotrophic lateral sclerosis gene therapy research. Exclusive criterial:Drug therapy; repetitive studies and experiential and individual literature report.DATA EXTRACTION: Totally 116 articles in all on amyo

4、trophic lateral sclerosis were collected ,of which 32 articles were selected.DATA SYNTHESIS: The pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis and SOD1 gene mutations may be relevant. When SOD1 genetic change, its code of protein conformation also produces change, enzyme activity reduced, scavenging

5、 free radicals ability. In amyotrophic lateral sclerosis gene therapy, neural factor can promote motor neuron in the survival and growth and repair, iRNA can delay the motor neuron degeneration of the development.CONCLUSION: For amyotrophic lateral sclerosis to explore its pathogenesis, for ALS gene

6、 therapy to lay the foundation, thus heal ALS.KEYWORDS: amyotrophic lateral sclerosis ;gene; gene therapy摘要：目的： 探討肌萎縮側(cè)索硬化癥在致基因和基因治療方面的研究進(jìn)展。資料來(lái)源：應(yīng)用計(jì)算機(jī)檢索Pubmed1993-2011年的文章，檢索詞為“amyotrophic lateral sclerosis,gene,gene therapy”,限定語(yǔ)言種類為中英文，同時(shí)計(jì)算機(jī)檢索維普數(shù)據(jù)庫(kù)2005-2011年期間的相關(guān)文章。資料選擇：對(duì)資料進(jìn)行初審，選取有關(guān)肌萎縮側(cè)索硬化癥方面的研究。納入選

7、標(biāo)準(zhǔn)：1.研究肌萎縮側(cè)索硬化癥的致病基因等方面的研究。2肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因治療的研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：1.藥物治療的研究。2.重復(fù)研究及經(jīng)驗(yàn)和個(gè)人報(bào)告文獻(xiàn)。資料提煉： 共檢索到116篇關(guān)于肌萎縮側(cè)索硬化癥致病基因及基因治療等研究的文獻(xiàn)，入選32篇。資料綜合： 肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)病機(jī)制可能和SOD1基因突變有關(guān)。當(dāng)SOD1基因發(fā)生改變時(shí)，其編碼的蛋白質(zhì)構(gòu)象也發(fā)生變化，酶活性減低，清除自由基能力下降。在肌萎縮側(cè)索硬化癥的基因治療方面，神經(jīng)因子可以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng)及其修復(fù)，iRNA可以延緩運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性發(fā)展。結(jié)論：對(duì)于肌萎縮側(cè)索硬化癥要不斷探索其發(fā)病機(jī)制，為ALS的基因治療打下基礎(chǔ)，從而

8、治愈ALS。關(guān)鍵詞：肌萎縮側(cè)索硬化癥;基因；基因治療0 引言肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的主要類型，以脊髓前角和腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及錐體束的慢性進(jìn)行變性，上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同時(shí)受損為特征。男性患者多見，一般在4050歲起病，發(fā)病后35年死亡。主要表現(xiàn)為脊髓和腦干所支配的肌肉無(wú)力、萎縮、肌束震顫、球麻痹和錐體束征；感覺系統(tǒng)一般不受累。目前ALS的病因和發(fā)病機(jī)制不明，也無(wú)特效治療。而分子生物學(xué)研究的迅速發(fā)展為ALS提供了新的治療策略。本文就近年來(lái)關(guān)于ALS的基因突變和基因治療的研究進(jìn)行了綜述。1.新致病基因的發(fā)現(xiàn)和遺傳學(xué)

9、研究的進(jìn)展SOD1基因突變與ALS有關(guān)已經(jīng)被公認(rèn)，在散發(fā)病例中占1%-4%，在家族遺傳病例中占20%左右。在家族ALS中是否存在其他的基因突變一直是學(xué)者們研究的重點(diǎn)。美國(guó)的Brown對(duì)16個(gè)沒(méi)有SOD1基因突變的常染色體顯性遺傳的ALS家族進(jìn)行基因連鎖分析，發(fā)現(xiàn)第16號(hào)染色體至少有3個(gè)新的突變位點(diǎn)，還提出16%的ALS患者可檢測(cè)到SMN2基因。 家族性的ALS(FALS)分12種亞型：ALS1-ALS8、合并ALS的額顳葉癡呆綜合征、X性連鎖遺傳的ALS、ALS癡呆帕金森綜合征、進(jìn)行性下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病等1。在不同的人群，約12-13%FALS和2%-7%的散發(fā)性ALS（SALS）患者有銅鋅超氧化

10、物歧化酶（SOD1）基因突變2。國(guó)內(nèi)李曉光等發(fā)現(xiàn)FALS的E133V和H46R基因突變位點(diǎn)；在AL中，發(fā)現(xiàn)了V29A、N861和V47A突變位點(diǎn)。樊東升等發(fā)現(xiàn)作為本病易感基因的VEGF啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)分布與歐美白人不同，且在中國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)VEGF啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)分布與起病年齡明顯相關(guān)3。目前還發(fā)現(xiàn)3個(gè)與FALS相關(guān)的基因，ALS1基因的SOD1，ALS2基因Alsin和ALS4基因Senetaxin。中國(guó)目前尚未見一個(gè)FALS位點(diǎn)報(bào)道，僅發(fā)現(xiàn)1例SOD1突變4，提示中國(guó)ALS具有與西方不同的發(fā)病機(jī)制，有不同的基因?qū)е轮袊?guó)FALS的發(fā)生。2 SOD1基因突變的特點(diǎn)SOD1基因組DNA長(zhǎng)12kb，含有5個(gè)

11、外顯子編碼153個(gè)氨基酸，組成33ku的金屬酶蛋白，具有清除自由基和抗氧化的功能。在FALS患者中，SOD1基因的2號(hào)外顯子編碼區(qū)發(fā)生插入突變導(dǎo)致mRNA的轉(zhuǎn)錄提前終止，使翻譯至第36號(hào)密碼子時(shí)遇到終止密碼子TAA，從而使SOD1蛋白質(zhì)翻譯提前終止。正常的SOD1蛋白由153個(gè)氨基酸組成，而突變后的SOD1蛋白質(zhì)為35個(gè)氨基酸組成的短肽。新突變的SOD1二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上保持了野生型SOD1中對(duì)應(yīng)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但改變了SOD1蛋白結(jié)構(gòu)的整體活性，導(dǎo)致突變的SOD1蛋白的抗氧化損傷作用減弱，自由基產(chǎn)生增多，使細(xì)胞膜、線粒體、軸突受損，影響軸漿運(yùn)輸5、6。3 基因治療3.1 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的治療 隨著

12、對(duì)ALS研究的不斷深入，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在ALS 治療中的作用逐漸受到重視，如睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）以及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）等。多項(xiàng)研究表明，CNTF可延緩Wobbler小鼠疾病的發(fā)展，減少肌萎縮，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和生長(zhǎng)7、8，但臨床結(jié)果不滿意9、10。研究表明，IGF-1可以促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)，增加損傷后脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率11。Sakowsk等通過(guò)對(duì)ALS患者進(jìn)行IGF-1治療后發(fā)現(xiàn)，它可以延緩ALS的進(jìn)展且對(duì)身體無(wú)副作用【12。但最近一項(xiàng)研究表明，皮下IGF-1治療并不能延緩ALS疾病的進(jìn)展13。BND

13、F 在大腦神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中合成，可以明顯增大神經(jīng)元胞體和促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)。體外研究證實(shí)，100ng/ml的BDNF可有效地促進(jìn)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫反應(yīng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活14。GDNF不僅促進(jìn)正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、降低細(xì)胞凋亡中自然發(fā)生的神經(jīng)元死亡，還對(duì)受損的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用。GDNF的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用比BDNF高75倍，比CTNF高650倍，是目前發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。Mohajen等發(fā)現(xiàn)GDNF還能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和生長(zhǎng)15。Storkebaum16將基因重組的VEGF經(jīng)腦室內(nèi)注入到ALS大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)治療鼠的發(fā)病時(shí)間和生存期分別延長(zhǎng)17d和22d。但對(duì)人類ALS

14、的治療試驗(yàn)尚在進(jìn)行中，需進(jìn)步觀察其療效和副作用。3.2 抗凋亡的基因治療細(xì)胞凋亡是ALS等的標(biāo)志之一。對(duì)進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。≒MN）的模型，轉(zhuǎn)入表達(dá)抗凋亡的Bcl-2或膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因可預(yù)防運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡，但對(duì)動(dòng)物的生存期沒(méi)有影響。Anna等研究者17將PMN小鼠與帶顯性突變Wlds基因的小鼠雜交，產(chǎn)生的PMN/Wlds鼠狀和生存期較PMN小鼠有一定程度改善，推測(cè)可能與Wlds基因產(chǎn)物減輕PMN小鼠逆向轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷有關(guān)。3.3 RNA抑制基因表達(dá)的治療 2001年出現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)（RNA interference,RNAi）,又稱基因沉默技術(shù)，是通過(guò)破壞細(xì)胞源性mRNA來(lái)阻止相

15、應(yīng)基因表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受病毒和其它遺傳因子的影響。Maxwell等18 的研究提示,在體外培養(yǎng)的小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞 中穩(wěn)定表達(dá)的人突 變SOD1使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒的刺激( 環(huán)胞菌素- A) 很敏感，當(dāng)用RNAi特異性減少突變SOD1表達(dá)時(shí)，可有效對(duì)抗環(huán)孢素-A引起的細(xì)胞死亡。Ralph和Raoul等19、20利用設(shè)計(jì)的一種慢病毒載體攜帶特異性抑制突變SOD1的RNAi，并將其注入ALS模型鼠的肌肉或脊髓內(nèi)。檢測(cè)證實(shí)動(dòng)物體內(nèi)突變SOD1的表達(dá)顯著減少，腦干和脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率明顯提高，同時(shí)可以有效的提高ALS模型鼠的運(yùn)動(dòng)能力以及延長(zhǎng)其壽命。Xie等的研究結(jié)果提示，靶向抑制前列腺凋亡反應(yīng)基因4

16、（Par-4）可能對(duì)變性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用。Par-4來(lái)自脊髓前角的突觸小體和后突觸致密區(qū)，可能是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的級(jí)聯(lián)事件中的一個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。利用RNAi技術(shù)降低Par-1表達(dá)，可減低由突變SOD1引起的突觸小體處caspase-3活性和線粒體障礙，從而減緩神經(jīng)元變性的發(fā)展。3.4 其它 最近發(fā)現(xiàn)ALS患者有編碼神經(jīng)絲重鏈(NF-H)的基因突變，因此利用腺病毒載體介導(dǎo)人類神經(jīng)絲輕鏈(NF L) 基因可以治療過(guò)度表達(dá)NF- H鼠，其發(fā)病和生存期平均延長(zhǎng)了6周左右。由于神經(jīng)絲輕鏈對(duì)神經(jīng)絲重鏈介導(dǎo) 的ALS發(fā)病有保護(hù)作用，故推測(cè)其也可能具有一定的治療作用21。Jiming認(rèn)為如果NF水平

17、增加出現(xiàn)在神經(jīng)元的胞體內(nèi)而不是軸突等處，可緩解ALS。并推測(cè)N F蛋白能減低運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元中突變SOD1蛋白的毒性，原因可能是大量NF蛋白形成了一個(gè)有效的蛋白池來(lái)吸收氧自由基等毒性物質(zhì)， 而避免后者對(duì)其他細(xì)胞器的損傷。4 結(jié)論 由于ALS發(fā)病機(jī)制可能涉及突變SOD1的“獲得毒性”、興奮性氨基酸毒性、線粒體障礙、軸突運(yùn)輸障礙、氧化損傷及細(xì)胞凋亡等方式，因此有效的ALS治療策略應(yīng)盡可能的兼顧多方面，且將副作用減到最低限度。從理論上講，致病基因的分析能夠?yàn)槲覀冞M(jìn)一步認(rèn)識(shí)疾病的病因?qū)W、摸清疾病的發(fā)病機(jī)制、闡明疾病的病理生理過(guò)程和開發(fā)藥物治療新靶點(diǎn)提供線索， 從而解決ALS在診療方面所帶來(lái)的諸多困惑。近年

18、來(lái)，盡管基因治療方法的基礎(chǔ)研究取得了一定成績(jī)，但離臨床應(yīng)用還有很大距離。當(dāng)前，ALS的臨床治療應(yīng)以提高其生存率，緩解其痛苦為標(biāo)準(zhǔn)，不斷提高基因診療技術(shù)，使ALS患者得到早期診斷、早期治療，延長(zhǎng)患者壽命，提高患者生活質(zhì)量，盡可能治愈ALS。5.參考文獻(xiàn)1. Kunst C B.Complex genetics of amyotrophic laterl scerosis J.Am J Hum Gener,2004,75:933.2. Voterra A ,Trotti D,Tromba C,ct al.Glutamate uptaker inhibition by oxygen free rad

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