1、精選優質文檔-傾情為你奉上touhun本科學生實驗報告僅供參考責任自負學號 姓 名 孫 永 升 學院 生命科學學院 專業、班級 10生物技術 實驗課程名稱 酶 工 程 教師及職稱 李 俊 俊 開課學期 2012 至 2013 學年 第二學期 填報時間 2013 年 5 月 29 日 云南師范大學教務處編印實驗名稱實驗方式小組成員實驗六 纖維素酶的固定化及其性質測定小組合作XXXXXXXX1、 實驗目的1.1了解酶制劑的固定化方法；1.2 學會固定化酶酶學特性的測定方法。 2、 實驗儀器、試劑和溶液：2.1 儀器：紫外分光光度計、比色皿（3個）、恒溫水浴鍋、試管架（1個）、l移液管、洗耳球、注射

2、器、標簽（若干）等。2 .2 試劑和溶液2 .2.1 檸檬酸鈣緩沖液，0.05mol/L，pH4.8;2 .2.2 10mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）;2 .2.3 DNS試劑（CMCA-DNS）;2 .2.4 稀釋到200倍的纖維素酶液;2 .2.5 2.5%、3.5%、4.5%、 5.5%的海藻酸鈣溶液;2 .2.6 2%的CaCl2溶液。3、實驗原理或裝置示意圖：3.1 酶的固定化 把游離的水溶性酶限制在某一局部空間或固體載體上，酶固定后既不會流失，也不會污染產品，而且穩定性得到提高可長期反復使用。3.2 最常用的固定化方法是包埋法。3.3 海藻酸鈣包埋法：通常是在其鈣鹽溶液中

3、加入二價離子（如Ca2+），通過Ca2+取代Na+來形成凝膠網絡。4、實驗方法步驟、操作流程及注意事項：4 .1 實驗方法：（一）酶液的準備（二）纖維素酶的固定化（三）固定化纖維素酶性質的測定4 .2 實驗操作步驟：1、將預先準備好的200倍纖維素酶液酶準確稀釋：固定化酶稀釋到1000倍，測游離酶稀釋到10000倍待用。2、纖維素酶的固定化：各取四瓶200mlCaCl2溶液于500ml三角瓶中待用。各取30ml不同濃度（2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）的海藻酸鈣于50ml小燒杯中，并分別取取稀釋到1000倍的纖維素酶液10ml加入不同濃度的海藻酸鈣溶液中，混合均勻。3、用注射器將上述混

4、合液取20ml（各取四次）逐漸滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中 靜止冷卻20min后,經固定化的小球紗布過濾晾干待用。4、準確稱取各個濃度制成的海藻酸鈣纖維素酶0.5g固定化小球，游離酶量取0.5ml，60預熱10min。5、準確計時后，于保溫后的酶液中依次加如CMC-Na溶液2.00mL振蕩混勻，在50水浴中繼續保溫30min（準確計時）。（固定化酶對照中不加入底物、游離酶對照中先不加入酶液）6、反應混合物物保溫 30min后，于各個濃度底物試管中加入3mLDNS試劑終止液，迅速振蕩均勻。（1）于游離酶對照中加入0.5 ml 的酶液。（2）于固定化酶對照中加入2.00mLCMC-Na溶

5、液。7、混合后將各個實驗組的三支試管沸水浴5min，自來水冷卻后，加蒸餾水19.5mL。搖勻，在540nm處讀取OD值。8、固定化酶與游離酶穩定性比較（操作按上面所述）：將得到的固定化纖維素酶（海藻酸鈣濃度為3.5%）與等量的游離纖維素酶分別在60下保溫10min、20min、30min、40min、50min，保溫后按標準方法進行酶活測定（分別做三個平行）。9、海藻酸鈣濃度對酶活性的影響：分別用2.5%、3.5%、4.5%和5.5%的海藻酸鈣濃度來固定化酶，并分別測定固定化酶的活性（分別做三個平行）。4.3 實驗注意事項本實驗耗時長在測定中盡量減少操作錯誤：應熟知流程、步驟。另：實驗所測定內

6、容較多，因此應小組分工合作配合完成。注意以下事項：酶液準確稀釋。移液管使用時量取精準，保證結果可靠準確。試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落；在纖維素酶固定化測定中是底物加入酶液：空白對照先不加底物，游離酶測定中空白對照先不加酶液。精確記時：每一管加入酶液的時間要做記錄，每管之間間隔的時間要合理；避免試管進水：煮沸和用流水沖洗時；5、實驗結果與數據處理：5.1實驗數據與結果：表一 固定化酶（3.5%）與游離酶穩定性的比較保溫時間（min）吸光度OD540、酶活 （u/g）、相對酶活(%) 固定化纖維素酶酶游離纖維素酶酶 10 0.0375 639.04 33.63

7、 0.0585 7586.50 65.23 20 0.2590 1900.61 100.00 0.0695 8213.01 70.62 30 0.1965 1544.64 81.27 0.0805 8839.53 76.00 40 0.1373 1207.46 63.53 0.1295 11630.36 100.0050 0.0570 653.46 34.38 0.0755 6008.00 51.66注：固定化酶所用源酶液稀釋1000，相對酶活以1900.61 u/g為100%計算；游離酶10000倍，相對酶活以11630.36u/g為100%計算.表二 不同海藻酸鈣濃度的固定化酶的活性海藻酸

8、鈣濃度（%） 吸光度OD540 固定化纖維素酶活（u/g） 相對酶活（%） 2.5 0.0295 593.48 63.853.5 0.0885 929.52 100.004.5 0.0390 741.15 79.735.5 0.0297 601.59 64.72注：相對酶活以本組測定酶活最高929.52 u/g為100%計算.5.2結果處理經統計軟件作圖分析結果如下：5.2.1 固定化酶（3.5%）與游離酶酶活穩定性的比較如圖一、二、三：圖一 圖二 圖三5.2.2不同海藻酸鈣濃度固定化酶的纖維素酶相對活性如圖四： 圖四結果：酶活(相對酶活)比較：固定化酶（3.5%）與游離酶酶活穩定性由圖一、二

9、、三可以看 出：海藻酸鈣（3.5%）所制成的纖維素固定化酶相對活性隨反應時間的增加在20min時到達最大100%，后逐漸減小。曲線在30min時與游離纖維素酶曲線有一個交點：時間增加固定化酶活性降低，40min時，纖維素游離酶活性達最大相對活性：100%，之后減低，酶相對活性遠遠高于固定化酶相對活性。酶穩定性比較：由圖三可看出在反應30min以后，游離酶的酶活穩定性保持升高 到40min達最大酶活，之后酶活（相對活性）急劇下降（曲線斜率較陡曲）；而固定化纖維素酶的酶活從20min后保持平緩的下降趨勢（斜率較緩），即穩定性較高。不同濃度的海藻酸鈣對固定化酶性質影響：隨著海藻酸鈣的濃度由：2.5%

10、、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈現增后減的趨勢，固定化纖維素酶酶活性在3.5% 達最大相對酶活性100%。 6、 分析與討論：酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內,仍能進行其特有的催化反應、并可回收及重復利用的一類技術。與游離酶相比,固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時,又克服了游離酶的不足之處,呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控、工藝簡便等一系列優點。固定化酶的制備方法有物理法和化學法兩大類。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。優點在于酶不參加化學反應,整體結構保持不變,酶的催化活性得到很好保留。實驗中所采用的時物理包埋法，采用海藻酸

11、鈣介質包埋纖維素酶制成固定化纖維素酶。（一）纖維素固定化酶與游離酶活性比較初步得出結論：3.5%海藻酸鈣固定所制得的酶到最大反應時其反應時間（20min）明顯短于游離酶的反應時間(40min);反映出固定化酶的優勢之一。（二）在探索不同海藻酸鈣濃度對固定化纖維素酶活性影響中，可以看到隨濃度的增加酶相對活性先增后減在3.5%時最大。由此我們初步確定海藻酸鈣固定纖維素酶的最適濃度。 （三）有實驗發現經固定化后纖維素酶的活性降低，但固定化酶的增加穩定性（溫度60，不同時間）與游離酶相比較增加。對于固定化酶活性受各種因素所影響：海藻酸鈣的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時間等。因此為確定固定化

12、纖維素酶所用海藻酸鈣準確濃度需進一步試驗采用單因子變量。由圖四可知, 在海藻酸鈣濃度（質量分數）為3.5% 時,固定化酶活力最大。當海藻酸鈣質量分數過大時,其黏度很大, 難以擠成球狀, 影響凝膠成型, 同時凝膠的孔徑也小, 影響酶與底物的結合。反之海藻酸鈣質量分數太小, 凝膠的孔徑較大, 固定化酶容易流失, 也會影響酶活。因此, 合適質量分數的海藻酸鈣易形成機械強度適宜的凝膠, 同時底物和產物易于從凝膠微孔擴散通過, 酶促反應速度較快, 所以選擇海藻酸鈣濃度（質量分數）3.5% 為宜。對酶固定化后酶穩定性提高的原因可能有以下幾點： 固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酶伸展變形； 酶活力的緩慢

13、釋放； 抑制酶的自降解，將酶與固態載體結合后，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了降解。7、實驗小結：掌握海藻酸鈣固定纖維素酶的基本原理與操作方法纖維。在海藻酸鈣固定纖維素酶中由于固定化效果受各種條件影響：海藻酸鈣的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時間等。因此實驗中嚴格控制除海藻酸鈣鈣外的因素。做到準確，減少實驗操作誤差，增加結果可信度。8、實驗思考題： 為什么海藻酸鈣濃度的固定化酶的活性產生影響？答：固定化條件對固定化酶活力的影響主要有：海藻酸鈣的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時間等。海藻酸鈣具有強烈的吸附作用，可與Ca2+、Cu2+等正二價陽離子迅速形成凝膠，海藻

14、酸鈣濃度過大凝膠的空徑越小，影響酶與底物結合；海藻酸鈣濃度太小，凝膠的孔徑較大，固定化容易流失，所以酶活較低。所以海藻酸鈣濃度有一個最佳濃度值。為什么海藻酸鈉濃度的固定化酶的活性產生影響？答：固定化條件對固定化酶活力的影響主要有：海藻酸鈉的濃度、氯化鈣的濃度、纖維素酶用量、固定化時間等。海藻酸鈉具有強烈的吸附作用，可與Ca2+、Cu2+等正二價陽離子迅速形成凝膠，海藻酸鈉濃度過大凝膠的空徑越小，影響酶與底物結合；海藻酸鈉濃度太小，凝膠的孔徑較大，固定化容易流失，所以酶活較低。所以海藻酸鈉濃度有一個最佳濃度值。9、參考文獻：1 魯玉俠, 蔡妙顏, 郭祀遠, 王兆梅. 海藻酸鈣包埋法制備固定化脂肪酶研究J. 現代食品科技, 2007,4(22):3032.2 潘利華, 羅建平, 查學強等